紫花苜蓿R2R3-MYB亚家族鉴定与干旱胁迫下的表达分析

摘要：MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）家族是最大的转录因子家族之一，R2R3-MYB亚家族在植物胁迫响应、次级代谢、生长和发育等过程发挥重要作用。本研究利用紫花苜蓿（Medicago sativa Zhongmu No.1）基因组和转录组数据，通过生物信息学方法鉴定了R2R3-MYB转录因子，并对其序列特征、系统进化、染色体分布、基因结构、顺式作用元件及干旱胁迫下的表达模式进行分析。结果显示，紫花苜蓿中有121个R2R3-MYB亚家族成员，各成员均具有两个典型的MYB结构域，理化性质变化较大。系统进化分析将121个成员分为33个组，各成员无规律地定位在8条染色体上。基因结构和顺式作用元件分析发现，同一分组具有相同或相似的外显子数和顺式作用元件。响应干旱胁迫表达模式分析和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果表明干旱胁迫下MsMYB12，MsMYB45，MsMYB52，MsMYB73，MsMYB88，MsMYB124，MsMYB149，MsMYB189，MsMYB268基因的表达量显著上调，可作为后期紫花苜蓿响应干旱胁迫机制研究的潜在靶点。

关键词：紫花苜蓿；R2R3-MYB；生物信息学分析；干旱胁迫；表达模式

中图分类号：S772.3+6文献标识码：A文章编号：1007-0435（2023）04-0972-12

Identification and Expression Analyses of R2R3-MYB Subfamily in

Alfalfa under Drought Stress

REN Ming-hui， ZHANG Yu-peng， XU Tao， ZHU Hui-sen CEN Hui-fang

（College of Grassland Science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：The MYB （v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog） family is one of the largest transcription factor families. The R2R3-MYB subfamily is widely involved in the stress response，secondary metabolism，growth and development of plant. In this study，R2R3-MYB transcription factors were identified in alfalfa. Their sequence characteristics，phylogenetic relationship，chromosome distributions，gene structures，cis-elements，and expression patterns under drought stress were analyzed by bioinformatic methods. The results showed that there were 121 members of the R2R3-MYB subfamily in Alfalfa. Each member had two typical MYB binding domains，the physical and chemical properties of which were yet different. These 121 members were divided into 33 groups by phylogenetic analysis，and each member was located irregularly on one of the 8 chromosomes. The analyses of gene structures and cis-elements showed that there were the same or similar numbers of exon and cis-elements within the same group. The expression levels of MsMYB12， MsMYB45，MsMYB52，MsMYB73，MsMYB88，MsMYB124，MsMYB149，MsMYB189， MsMYB268 genes were significantly up-regulated in response to drought stress. It provides potential targets for studying the mechanism of R2R3-MYB transcription factor genes in response to drought stress in alfalfa.

Key words：Alfalfa;R2R3-MYB;Bioinformatic analysis;Drought stress;Expression patterns

转录因子是真核生物进化过程中形成的一类特有的蛋白，能与基因启动子区的特定位点结合，从而起到调控转录的作用［1］。转录因子以其靶向DNA结构域的相似性被划分为不同家族［2］。MYB转录因子因具有保守的MYB结构域而得名，是植物中成员数量最多的转录因子家族之一［3］。MYB转录因子的N端高度保守，该区域包含1至4个相邻的不完全重复序列，每个重复由约50个氨基酸残基组成［4］。根据氨基酸序列中串联重复的数目，MYB家族被分为4个主要的亚族：1R-MYB，R2R3-MYB，R1R2R3-MYB和4R-MYB［5］。植物中大多数MYB属于R2R3-MYB类转录因子［6］。通常R2R3-MYB转录因子由两种模式进化而来：一种通过R1R2R3-MYB结构域缺失一个重复产生；另外一种由1R-MYB结构域的复制产生［3，5］。R2R3-MYB亚家族在植物的逆境胁迫调节中发挥着重要的作用。近来有大量关于R2R3-MYB亚家族鉴定及参与植物非生物胁迫的报道。小麦（Triticum aestivum）、青钱柳（Cyclocarya paliurus）、烟草（Nicotiana tabacum）、菠萝（Ananas comosus）的相关报道中分别鉴定出了393个、69个、174个、103个R2R3-MYB转录因子基因，其中部分基因已被证明参与了干旱、高温、低温及盐胁迫等非生物胁迫的响应［7-10］。Zhang等基于垂丝海棠（Malus halliana）铁缺乏转录组数据发现14个R2R3-MYB转录因子基因在缺铁胁迫下差异表达，并证明MhR2R3-MYB4能够提高拟南芥对缺铁的耐受性［11］。

紫花苜蓿（Medicago sativa）因其营养品质高、产量高、适应性强等优点，是种植最广泛的牧草之一，有“牧草之王”的美誉［12-13］。在中国，紫花苜蓿的种植区主要分布在西北、东北、华北等半干旱地区，干旱是限制其产量和地理分布的主要因素之一［14-15］。因此，提高紫花苜蓿的干旱适应性对我国北方畜牧业的发展具有重要意义。干旱导致植物代谢异常进而影响植株正常生长，而植物通过相关基因调控对干旱胁迫的感知、响应，以维持正常生长［16-17］。其中，R2R3-MYB亚家族基因在非生物胁迫响应中发挥着重要作用，是值得挖掘的一类调控干旱胁迫的基因［18］。本文利用生物信息学方法对紫花苜蓿R2R3-MYB亚家族进行了鉴定，对R2R3-MYB转录因子的序列特征、系统进化、基因染色体分布、基因结构及顺式作用元件进行了系统的分析。此外，通过对紫花苜蓿响应干旱胁迫的转录组数据分析及qRT-PCR验证确定9个R2R3-MYB家族成员是潜在的干旱胁迫抗性基因。本研究为探讨紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子的基因功能提供了基础，也为后续紫花苜蓿耐旱品种改良提供靶点。

1材料与方法

1.1MYB转录因子的鉴定

利用紫花苜蓿（Medicago sativa Zhongmu No.1）基因组数据（https：//figshare.com/articles/dataset/Medicago_sativa_genome_and_annotation_files/12623960）和MYB保守结构域的隐马尔可夫模型文件（PF00249），用HMMER3.0搜索含有MYB结构域的蛋白序列，E-value值设为0.001。把搜索到的含MYB结构域的序列在保守结构域数据库（Conserved domains database，CDD）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）中进行鉴定，剔除结构域不完整序列后，根据MYB结构域的数目最终筛选出R2R3-MYB转录因子。同时，我们从拟南芥（Arabidopsis thaliana）信息资源数据库（The arabidopsis information resource，TAIR）（https：//www.arabidopsis.org/）获取拟南芥R2R3-MYB转录因子序列进行后续分析。

1.2序列特征分析

紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子氨基酸序列的大小，理论等电点和分子质量通过ExPasy网站（https：//www.expasy.org/）进行预测。同时，通过WebLogo在线工具（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）绘制拟南芥和紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子R2和R3重复的序列标签图。

1.3紫花苜蓿R2R3-MYB基因染色体定位分析

从中苜1号基因注释文件中获取组装的染色体信息及MYB基因的染色体定位信息，根据MYB基因在染色体上的顺序进行编号。利用MG2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）在线工具，绘制R2R3-MYB基因的染色体定位图［19］。

1.4紫花苜蓿R2R3-MYB亚家族系统进化分析

利用多序列比对工具Muscle对紫花苜蓿和拟南芥R2R3-MYB转录因子进行多序列比对，参数采用系统默认参数。通过分子进化遗传分析软件MEGA7.0构建系统发生树（采用邻接法，泊松模型，系统参数设置为1000自举值）［20］。根据拟南芥R2R3-MYB转录因子的分类情况对紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子进行分组［5］。

1.5紫花苜蓿R2R3-MYB基因结构预测和顺式作用元件分析

从中苜1号基因注释文件中获取R2R3-MYB基因的内含子和外显子信息用于绘制基因结构图；从中苜1号基因组中提取R2R3-MYB基因起始密码子上游1 000 bp的序列，并提交到PlantCARE进行顺式作用元件的预测［21］。根据获得的基因结构信息和顺式作用元件预测信息，利用Tbtools绘制R2R3-MYB基因的顺式作用元件和基因结构图［22］。

1.6紫花苜蓿R2R3-MYB基因响应干旱胁迫的表达模式分析

从中苜1号转录组（PRJNA450305）中获取400 mmol·L-1甘露醇模拟干旱胁迫处理0 h，3 h，6 h，12 h，24 h的数据以及10 μmol·L-1响应干旱胁迫主要激素ABA处理1 h，3 h，12 h的数据作为表达模式分析的基础数据［23-24］。之后，通过hisat2建立紫花苜蓿基因组的索引，并将转录组数据比对到紫花苜蓿基因组中，利用FeatureCounts进行计数，并计算TPM值，用log2（TPM+1）值绘制干旱胁迫下紫花苜蓿R2R3-MYB基因的表达模式图。

1.7紫花苜蓿R2R3-MYB基因qRT-PCR分析

植物材料为中苜1号紫花苜蓿，于2022年8月种植在蛭石∶沙=1∶1的基质中，置于人工气候箱中，培养条件为昼/夜温度25℃/20℃，湿度65%，光照/黑暗时间16 h/8 h。出苗后，每3 d用1/2 Hoagland营养液浇灌。待幼苗生长至4周龄，取出植株，于1/2 Hoagland中培养24 h后分别用含500 mmol·L-1甘露醇和80 μmol·L-1 ABA的1/2 Hoagland进行胁迫处理，采集甘露醇处理0，3 h，6 h，12 h和ABA处理0，1 h，3 h，12 h的叶片，用于qRT-PCR检测。

总RNA提取采用快速通用植物RNA提取试剂盒3.0（北京华越洋生物科技有限公司），用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测总RNA浓度，利用PrimeScript RT reagent kit with gDNA eraser（Perfect Real Time）（RR047，TaKaRa，宝生物工程有限公司）将总RNA反转录为cDNA。利用Primer3进行引物设计，引物序列见表1，其中β-Actin为内参基因。qRT-PCR采用Bio-Rad CFX96系统，每个反应体系中含有cDNA模板1 μL、上下游引物各1 μL、TB Green Premix Ex Taq II （TaKaRa，宝生物工程有限公司）10 μL和无菌水7 μL。qRT-PCR反应循环条件为：95℃，30 s；95℃，10 s；60℃，30 s；72℃，10 s；40个循环。实验设置3次重复，基因相对表达量使用FC=2-ΔΔCt方法计算。

1.8数据处理

实时荧光定量数据通过Excel 2019进行整理，SPSS 11.0软件进行显著性分析。

2结果与分析

2.1紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子鉴定

在紫花苜蓿基因组数据库中共获得277个MYB转录因子序列。根据上述MYB转录因子的分类方法，将紫花苜蓿MYB转录因子分为4类，分别为1R-MYB，R2R3-MYB，R1R2R3-MYB和4R-MYB，其中1R-MYB有148个，R2R3-MYB有121个，R1R2R3-MYB有7个，4R-MYB有1个。根据MYB基因在染色体的顺序编号为MsMYB1～MsMYB274。此外，MsMYB275，MsMYB276，MsMYB277以所在contig的顺序编号。表2为R2R3-MYB转录因子的基因ID、编号及理化性质。

2.2紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子序列特征分析

紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子的氨基酸长度、分子质量和等电点预测结果显示，R2R3-MYB转录因子中分子量最小的是MsMYB74转录因子，由119个氨基酸残基组成，分子量最大的MsMYB8转录因子，由1 771个氨基酸残基组成，氨基酸残基数200～500个的转录因子有94个，占R2R3-MYB转录因子总数的77.7%，R2R3-MYB转录因子分子质量分布范围为1 388.94～1 196 154.61 Da；蛋白等电点（Isoelectric point，pI）最小的是MsMYB65转录因子（4.74），等电点最大的是MsMYB47转录因子（10.15），pIlt;6.5的酸性蛋白55个，占总数的45.5%，pIgt;7.5的碱性蛋白51个，占总数的42.1%，中性蛋白15个，占总数的12.4%，表明紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子亚家族蛋白理化性质具有多样性。

为了进一步探究R2R3-MYB转录因子的序列特征，我们绘制了R2和R3重复每个位点氨基酸出现的频率图。如图1所示，紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子的R2和R3重复由约108个氨基酸残基组成。同拟南芥相似，紫花苜蓿R2和R3重复中的第9，30，50，82，101位分布着高度保守的色氨酸残基（W），R3重复的第63位色氨酸（W）常被苯丙氨酸（F）或异亮氨酸（I）取代，除高度保守的色氨酸残基之外，R2和R3重复中分别含有高度保守的谷氨酸（E-12）～谷氨酸（E-13）～天冬氨酸（D-14）残基和谷氨酸（E-66）～谷氨酸（E-67）～谷氨酸（E-68）残基。紫花苜蓿R2和R3重复的一些位点与拟南芥存在一定的差异，如：R2重复的第2，19，22和40位，R3重复的第77，87和110位。

序列特征分析表明紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子的R2，R3重复保守性较高（图1），但蛋白质的理化特性具有较大的差异（表2）。因此，有必要进一步了解紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子的基因特征。

2.3紫花苜蓿R2R3-MYB亚家族系统进化分析

对紫花苜蓿和拟南芥R2R3-MYB转录因子构建系统进化树，根据已报道的拟南芥R2R3-MYB转录因子分组情况，将紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子分为20个组［5］，其中未有文献报道的分组编号为M1—M13（图2）。从紫花苜蓿与拟南芥R2R3-MYB转录因子进化树中发现，拟南芥S15，S16，S24组没有紫花苜蓿序列，紫花苜蓿M1，M2，M11，M13分组中没有拟南芥序列，表明R2R3-MYB亚家族在植物进化中的多样性。聚集在同一分组的成员序列保守性较高，其基因功能也可能具有一定的相似性，在拟南芥中S1，S2，S11，S18，S20，S22分组与非生物胁迫有关，MsMYB181基因处于S1分组，MsMYB12基因处于S2分组，MsMYB71，MsMYB132，MsMYB48基因处于S11分组，MsMYB30，MsMYB31，MsMYB246，MsMYB81，MsMYB1，MsMYB67，MsMYB271，MsMYB176，MsMYB20基因处于S18分组，MsMYB268，MsMYB52，MsMYB36，MsMYB44基因处于S20分组，MsMYB144基因处于S22分组中，这些基因可能参与紫花苜蓿非生物胁迫调控。

2.4紫花苜蓿R2R3-MYB基因染色体定位

根据Shen等对中苜1号基因组的注释信息［12］，对编码R2R3-MYB转录因子的基因进行染色体定位分析，结果显示，119个成员定位到8条染色体上，2个成员定位到未完全组装的contig上；其中1号染色体上R2R3-MYB转录因子基因最多，有21个成员，占R2R3-MYB基因总数的17.4%；其次是7号染色体，有20个R2R3-MYB基因；6号染色体含有R2R3-MYB基因数目最少，仅为10个成员。染色体长度和含有的R2R3-MYB基因数量没有明显的相关性，但在Chr1，Chr5，Chr7和Chr8上分布密集，推断与R2R3-MYB转录因子基因的串联复制有关。

2.5紫花苜蓿R2R3-MYB基因结构分析及顺式作用元件预测

为了分析紫花苜蓿R2R3-MYB亚家族的基因结构特征，绘制了基因结构图（图4）。121个R2R3-MYB基因包含不同数目的外显子，从1到22个不等，多数R2R3-MYB基因含3个外显子。结合进化树分组发现，聚集在同一分组的R2R3-MYB基因有相同或接近数目的外显子，同一分组的基因结构具有一定的相似性，提示这些基因可能具有相似的功能。

为了进一步分析紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子的功能，对R2R3-MYB转录因子基因上游1 000 bp区域进行了顺式作用元件检测，以推测紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子基因的功能。两类顺式作用元件被检测到，一类与生长发育有关，一类与胁迫响应有关（图4）。与生长发育有关的顺式作用元件包括：MYB结合位点（MYB），光响应元件（Box-4，G-box，GT1-motif，Sp），MYBHv1结合位点（CCAAT-box），分生组织活性位点（O2-site），分生表达元件（CAT-box）。与胁迫有关的顺式作用元件有：厌氧响应元件（ARE），茉莉酸甲酯响应元件（TGACG-motif和CGTCA-motif），ABA响应元件（ABRE），干旱胁迫响应元件（MBS）。结合进化树分组发现，聚集在同一分组的R2R3-MYB基因上游含有相同或相似的与生长发育和非生物胁迫相关的顺式作用元件，推测R2R3-MYB基因能够参与非生物胁迫调控，且在不同生长发育时期发挥作用。

2.6紫花苜蓿R2R3-MYB基因干旱胁迫下的表达模式分析

基因表达模式分析可以为基因功能研究提供重要依据，为了获取干旱胁迫下紫花苜蓿R2R3-MYB基因的表达模式，根据甘露醇模拟干旱胁迫处理3 h（M1），6 h（M2），12 h（M3），24 h（M4）以及ABA处理1 h（ABA1），3 h（ABA2），12 h（ABA3）的转录组数据，以0 h（CK）处理为对照绘制了51个差异性表达R2R3-MYB基因的热图。根据聚类结果，将51个基因分为A—D四个组，与对照相比，D组R2R3-MYB基因表达在甘露醇和ABA处理下被不同程度地诱导；B组9个基因的表达在甘露醇和ABA处理下被诱导，1个基因的表达被抑制。51个差异性表达的R2R3-MYB基因中，MsMYB12，MsMYB45，MsMYB52，MsMYB73，MsMYB88，MsMYB124，MsMYB149，MsMYB189，MsMYB268基因在甘露醇和ABA处理下表达量均显著上调；MsMYB32，MsMYB102，MsMYB272，MsMYB128，MsMYB97，MsMYB71基因随甘露醇处理时长增加，表达量呈先升高后降低趋势；MsMYB26，MsMYB118，MsMYB232基因在甘露醇处理下表达量下调（图5）。

2.7紫花苜蓿R2R3-MYB基因qRT-PCR分析

根据图5中的结果，为了进一步确认紫花苜蓿R2R3-MYB基因在干旱胁迫下的表达情况，选取9个紫花苜蓿R2R3-MYB基因进行qRT-PCR试验验证。结果显示甘露醇和ABA处理对上述R2R3-MYB转录因子基因均有显著调控作用。其中，甘露醇处理组均显著上调，尤其是在12 h时间点，表达量变化最为明显。而在ABA处理条件下，整体随着ABA处理时长增加，表达量呈现出升高的趋势，但是也存在一定的波动，如：MsMYB88基因的表达量先增加后降低，这可能是由于ABA作为干旱的重要信使在处理过程中对植株的调控网络存在一定的扰动。我们的qRT-PCR结果与图5中的结果存在一定差异，如MsMYB52，MsMYB124，MsMYB149在甘露醇处理3 h时间点的表达量没有显著变化，可能是转录组和qRT-PCR试验的样本来源与处理时间不同所导致的。

3讨论

在植物中，MYB转录因子家族是最大的一类，可调控多种生物学过程和代谢通路。本文对紫花苜蓿MYB转录因子家族进行鉴定，并对筛选出的R2R3-MYB转录因子基因进行染色体定位、系统进化分析、基因结构预测、顺式作用元件预测及干旱胁迫下的表达模式分析。共有277个MYB基因被鉴定到，包括121个R2R3-MYB基因，占总MYB基因的43%，此结果和Li等在马铃薯（Solanum tuberosum）中鉴定的有111个R2R3-MYB基因占总MYB基因的44%相似［25］。在拟南芥中有126个R2R3-MYB基因，占总MYB家族的64.29%［2］，在辣椒（Capsicum annuum）中鉴定出108个R2R3-MYB基因，占总MYB基因的50%［26］。植物R2R3-MYB亚家族成员占MYB家族较大一部分比例，这可能是在进化过程中R2R3-MYB基因处于有利地位，发生了基因扩张所导致的［27］。

植物在适应环境的过程中，进化出了相应的性状，调控这些性状的基因各异。紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子各成员中，基因长度各异，编码的蛋白理化性质差异性较大，但这些转录因子的特征性区域R2和R3重复序列高度保守，与毛果杨（Populus trichocarpa）、柑橘（Citrus sinensis）等的结果一致［28-29］。R2和R3重复通过结合基因上游启动子区调控基因的转录而发挥功能，在不同植物中R2和R3重复序列高度保守，推断R2R3-MYB转录因子的功能具有的相似性。

基因的系统进化关系是研究基因功能的重要参考，进化关系相近的基因功能具有相似性，拟南芥中S1，S2，S11，S18，S20，S22分组与非生物胁迫有关［5］，推断处于这些分组的紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子可能与干旱胁迫有关，但仍需后续进一步验证。紫花苜蓿与拟南芥的R2R3-MYB转录因子大部分能聚于同一分组，表明R2R3-MYB转录因子在不同物种间具有保守性，但是并不是所有紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子都能与拟南芥聚在同一分组，可能这些转录因子基因是后期进化获得的，或者进化过程中出现了基因丢失的情况［30］。

基因结构预测结果显示聚集在同一分组的R2R3-MYB基因有相同或接近数目的外显子数，与Wang等报道的结果一致［4］，同一分组内基因的结构相似，基因的进化关系相近，那么可以推断同一分组基因的功能相似。基因启动子区域顺式作用元件预测显示，紫花苜蓿25.62%（31/121）的R2R3-MYB基因具有MBS顺式作用元件，顺式作用元件MBS是响应干旱胁迫的主要元件［31］，说明这些R2R3-MYB基因可能与干旱胁迫有关；紫花苜蓿29.75%（36/121）的R2R3-MYB基因具有ABRE顺式作用元件，ABRE是ABA响应的主要顺式元件［32］，有研究报道，ABA信号通路在MYB介导的植物耐旱性中起着重要作用［33］，过表达TaMYB33可通过ABA介导的胁迫响应信号，提高拟南芥的耐旱、耐盐能力［34］，过表达拟南芥MYB37可以通过增强对ABA的敏感性，提高拟南芥干旱胁迫耐受性［35］，初步判断R2R3-MYB基因可以通过ABA途径调控紫花苜蓿干旱胁迫耐受性。

基因表达模式的阐明可以为研究基因功能提供重要线索，R2R3-MYB基因在植物抵抗各种非生物胁迫中起着重要的调控作用［36］。紫花苜蓿中51个R2R3-MYB基因的表达受甘露醇、ABA处理影响，说明这些基因可能参与干旱胁迫调控。有研究报道，拟南芥AtMYB2能够提高ABA敏感性，以诱导干旱胁迫相关基因表达，提高干旱胁迫耐受性，MsMYB52，MsMYB268和AtMYB2处于系统发育树的S20分组，推断MsMYB52和MsMYB268能在紫花苜蓿的干旱胁迫响应中发挥作用［37］。过表达AtMYB37能够提高拟南芥对ABA的敏感性，以提高干旱胁迫耐受性，MsMYB73，MsMYB124和AtMYB37处于系统发育树的S14分组，推断MsMYB73和MsMYB124可以通过ABA途径提高紫花苜蓿的干旱胁迫耐受性［35］。此外，基因启动子区域顺式作用元件预测结果显示MsMYB45，MsMYB88，MsMYB124，MsMYB149，MsMYB189，MsMYB268启动子区含有MBS或ABRE顺式作用元件，推测这些基因可以参与紫花苜蓿干旱胁迫响应。qRT-PCR验证结果证明了MsMYB12，Ms-MYB 45，MsMYB 52，MsMYB 73，MsMYB 88，Ms-MYB124，MsMYB149，MsMYB189，MsMYB268基因具有响应干旱胁迫的功能。

4结论

紫花苜蓿基因组中有121个R2R3-MYB亚家族成员，各成员均具有两个典型的MYB结构域，理化性质有较大差异。R2R3-MYB转录因子基因可能在植物生长发育和逆境胁迫中发挥着重要作用，转录组数据及qRT-PCR结果表明在干旱胁迫下MsMYB12，MsMYB45，MsMYB52，MsMYB73，Ms-MYB88，MsMYB124，MsMYB149，MsMYB189，Ms-MYB268表达量显著上调，为后期紫花苜蓿R2R3-MYB转录因子基因响应干旱胁迫的机制研究提供潜在靶点。

参考文献

［1］PABO C O，SAUER R T. Transcription Factors：Structural Families and Principles of DNA Recognition［J］. Annual Review of Biochemistry，1992，61（1）：1053-1095

［2］STRACKE R，WERBER M，WEISSHAAR B. The R2R3-MYB Gene Family in Arabidopsis thaliana［J］. Current Opinion in Plant Biology，2001，4（5）：447-456

［3］AMBAWAT S，SHARMA P，YADAV N R，et al. MYB Transcription Factor Genes as Regulators for Plant Responses：an Overview［J］. Physiology and Molecular Biology of Plants，2013，19（3）：307-321

［4］WANG Y J，ZHANG Y，FAN C J，et al. Genome-Wide Analysis of MYB Transcription Factors and Their Responses to Salt Stress in Casuarina equisetifolia［J］. BMC Plant Biology，2021，21（1）：1-17

［5］DUBOWS C，STRACKE R，GROTEWOLD E，et al. MYB Transcription Factors in Arabidopsis［J］. Trends in Plant Science，2010，15（10）：573-581

［6］李春艳，王曦，周胜花，等. 白羊草R2R3-MYB转录因子的挖掘及对干旱胁迫反应的研究［J］. 草地学报，2020，28（6）：1784-1790

［7］WEI Q H，CHEN R，WEI X，et al. Genome-Wide Identification of R2R3-MYB Family in Wheat and Functional Characteristics of the Abiotic Stress Responsive Gene TaMYB344［J］. BMC Genomics，2020，21（1）：1-16

［8］ZHANG Z J，ZHANG L，LIU Y，et al. Identification and Expression Analysis of R2R3-MYB Family Genes Associated with Salt Tolerance in Cyclocarya paliurus［J］. International Journal of Molecular Sciences，2022，23（7）：1-18

［9］YANG J H，ZHANG B H，GU G，et al. Genome-Wide Identification and Expression Analysis of the R2R3-MYB Gene Family in Tobacco （Nicotiana tabacum L.） ［J］. BMC Genomics，2022，23（1）：1-21

［10］陈哲，胡福初，阮城城，等. 菠萝R2R3-MYB基因家族鉴定与表达分析［J］. 热带植物学报，2019，40（10）：1958-1971

［11］ZHANG Z X，ZHANG R，WANG S C，et al. Identification of Malus halliana R2R3-MYB Gene Family under Iron Deficiency Stress and Functional Characteristics of MhR2R3-MYB4 in Arabidopsis thaliana［J］. Plant Biology，2022，24（2）：344-355

［12］SHEN C，DU H L，CHEN Z，et al. The Chromosome-Level Genome Sequence of the Autotetraploid Alfalfa and Resequencing of Core Germplasms Provide Genomic Resources for Alfalfa Research［J］. Molecular Plant，2021，13（9）：1259-1261

［13］杨帆，韦宝，王瑜，等. 紫花苜蓿产量、品质和根系对刈割高度的响应［J］. 草地学报，2022，30（6）：1597-1602

［14］方明月，汪溢磐，赵奕，等. 低温干旱复合胁迫对8个紫花苜蓿品种形态和生理特征的影响［J］. 草地学报，2022，30（11）：2967-2974

［15］魏娜，李艳鹏，马艺桐，等. 全基因组水平紫花苜蓿TCP基因家族的鉴定及其在干旱胁迫下表达模式分析［J］. 草业学报，2022，31（1）：118-130

［16］MUVUNYI B P，YAN Q，WU F，et al. Mining Late Embryogenesis Abundant （LEA） Family Genes in Cleistogenes songorica a Xerophyte Perennial Desert Plant ［J］. International Journal of Molecular Sciences，2018，19（11）：1-15

［17］ZHU J K. Abiotic Stress Signaling and Responses in Plants［J］. Cell，2016，167（2）：313-324

［18］WU W H，ZHU S，ZHU L M，et al. Characterization of the Liriodendron chinense MYB Gene Family and its Role in Abiotic Stress Response［J］. Frontiers in Plant Science，2021，12（6）：1-19

［19］CHAO J T，LI Z Y，SUN Y H，et al. MG2C：a User-Friendly Online Tool for Drawing Genetic Maps［J］. Molecular Horticulture，2021，1（12）：1-4

［20］KUMAR S，STECHER G，TAMURA K. MEGA7：Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets［J］. Molecular Biology and Evolution，2016，33（7）：1870-1874

［21］MAGALI L，DHAIS P，THIJS G，et al. PlantCARE，a Database of Plant Cis-acting Regulatory Elements and a Portal to Tools for in Silico Analysis of Promoter Sequences［J］. Nucleic Acids Research，2002，30（1）：325-327

［22］CHEN C J，CHEN H，ZHANG Y，et al. TBtools：an Integrative Toolkit Developed for Interactive Analyses of Big Biological Data［J］. Molecular Plant，2020，13（8）：1194-1202

［23］LUO D，ZHOU Q，WU Y G，et al. Full-length Transcript Sequencing and Comparative Transcriptomic Analysis to Evaluate the Contribution of Osmotic and Ionic stress Components Towards Salinity Tolerance in the Roots of Cultivated Alfalfa （Medicago sativa L.）［J］. BMC Plant Biology，2019，19（1）：1-20

［24］LUO D，WU Y G，LIU J，et al. Comparative Transcriptomic and Physiological Analyses of Medicago sativa L. Indicates that Multiple Regulatory Networks are Activated during Continuous ABA Treatment［J］. International Journal of Molecular Sciences，2018，20（1）：1-22

［25］LI Y M，WANG K L，LIU Z，et al. Genome-Wide Analysis and Expression Profiles of the StR2R3-MYB Transcription Factor Superfamily in Potato （Solanum tuberosum L.）［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2020，148（4）：817-832

［26］WANG J，LIU Y，TANG B Q，et al. Genome-Wide Identification and Capsaicinoid Biosynthesis-Related Expression Analysis of the R2R3-MYB Gene Family in Capsicum annuum L.［J］. Frontiers in Genetics，2020，11（12）：1-12

［27］王岚春，沈方圆，欧阳丹，等. 簸箕柳R2R3-MYB转录因子家族全基因组分析［J］. 四川大学学报（自然科学版），2022，59（3）：153-162

［28］WILKINS O，NAHAL H，FOOMG J，et al. Expansion and Diversification of the Populus R2R3-MYB Family of Transcription Factors［J］. Plant Physiology，2008，149（2）：981-993

［29］HOU X J，LI S B，LIU S R，et al. Genome-Wide Classification and Evolutionary and Expression Analyses of Citrus MYB Transcription Factor Families in Sweet Orange［J］. PLoS One，2014，9（11）：1-16

［30］居利香，雷欣，赵成志，等. 辣椒MYB基因家族的鉴定及与辣味关系分析［J］. 园艺学报，2020，47（5）：875-892

［31］KATIYAR A，SMITA S，LENKA S K. Genome-Wide Classification and Expression Analysis of MYB Transcription Factor Families in Rice and Arabidopsis［J］. BMC Genomics，2012，13（10）：1-19

［32］YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，SHINOZAKI K. Transcriptional Regulatory Networks in Cellular Responses and Tolerance to Dehydration and Cold Stresses［J］. Annual Review of Plant Biology，2006，57（1）：781-803

［33］WANG X P，NIU Y L，ZJENG Y，et al. Multiple Functions of MYB Transcription Factors in Abiotic Stress Responses［J］. International Journal of Molecular Sciences，2021，22（11）：1-14

［34］QIN Y X，WANG M C，TIAN Y C，et al. Over-expression of TaMYB33 Encoding a Novel Wheat MYB Transcription Factor Increases Salt and Drought Tolerance in Arabidopsis［J］. Molecular Biology Reports，2012，39（2）：7183-7192

［35］YU Y T，WU Z W，LU K，et al. Overexpression of the MYB37 Transcription Factor Enhances Abscisic Acid Sensitivity，and Improves both Drought Tolerance and Seed Productivity in Arabidopsis thaliana［J］. Plant Molecular Biology，2015，90（3）：267-279

［36］DU H，ZHANG L，LIU L，et al. Biochemical and Molecular Characterization of Plant MYB Transcription Factor Family［J］. Biochemistry，2009，74（1）：1-11

［37］ABE H，URAO T，ITO T，et al. Arabidopsis AtMYC2 （bHLH） and AtMYB2 （MYB） Function as Transcriptional Activators in Abscisic Acid Signaling［J］. Plant Cell，2003，15（1）：63-78

（责任编辑 闵芝智）