不同丙酸浓度对天然牧草青贮品质及有氧稳定性的影响

张佳伟， 贾玉山*， 格根图， 王志军， 包 健， 李宇宇， 彭 冬， 王 宇， 孙鹏波， 岳晓明

(1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院， 农业农村部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室， 内蒙古 呼和浩特 010019； 2.乌海市检验检测中心， 内蒙古 乌海市 016000； 3.乌拉盖管理区绿野草业有限公司， 内蒙古 锡林浩特 026000)

当前畜牧业快速发展导致饲草料的需求不断增加，同时我国天然草地资源丰富，据统计天然草地中具有饲用价值的牧草高达6 000余种，优势饲用牧草也有300余种[1]，可为饲草料的需求提供更多来源。放牧和刈割是天然草地的主要利用方式[2]，刈割后的牧草可进行干草调制或进行青贮利用，干草调制是目前草原牧区的主要贮藏利用方式，由于干草调制受到多方面因素的影响，使得牧草营养的损耗非常大[3]。不当的贮藏方式会造成牧草发生霉烂变质现象，浪费极为严重。青贮可以更好的保存牧草的营养成分，提高利用率，是一种较为高效的牧草加工贮藏方式。然而，相较于其他牧草，天然牧草存在一定的调制问题，其具有较高的缓冲能值和较低的乳酸菌附着量、含水量、WSC含量[4]，青贮过程中pH值难以降低，使腐败细菌大量滋生，导致有氧稳定性降低，容易腐败变质。为克服这个问题，需要制定能够有效抑制发酵过程中腐败和不良微生物生长、改善营养保存、延长青贮饲料有氧稳定性的策略。

青贮饲料有机酸添加剂可以抑制青贮发酵过程中不良微生物的生长，提高青贮饲料品质，防止青贮饲料有氧变质，有机酸添加剂在青贮饲料调制中已广泛应用[5-6]。丙酸作为有机酸添加剂之一，在青贮饲料中已表现出优异效果。研究表明，在杂交狼尾草(Pennisetumamericanum×P.purpureum)青贮中添加丙酸可以降低青贮饲料中的pH值，有效抑制不良微生物的活动，从而阻止了不良微生物对CP的降解及WSC的利用，使青贮饲料中CP及WSC含量提升，促进发酵，提高青贮饲料发酵品质[7]。在其他青贮原料中丙酸添加剂也已广泛应用[8-9]，对于青贮品质的改善都具有优异效果。另一方面丙酸可作为干草防霉剂抑制微生物的活动和植物细胞的代谢，使干草贮藏过程中的温度、pH值及霉菌和酵母菌的数量降低，CP和WSC的含量提高[10]，使干草的营养成分在贮藏中得以良好的保存。在有氧稳定性方面，丙酸可抑制青贮饲料在有氧暴露过程中霉菌和酵母菌的生长[11-12]，改善青贮饲料的有氧稳定性。

目前，对天然牧草青贮的研究大多集中在切割长度、填装密度、含水量、添加剂种类对天然牧草青贮品质的影响方面[13-15]，关于丙酸作为青贮添加剂的研究主要集中在对于全株玉米(Zeamays)、燕麦(Avenasativa)、紫花苜蓿(Medicagosativa)等人工饲草作物的青贮品质及有氧稳定性方面[16-18]，另一方面在干草贮藏中丙酸常作为干草防霉剂使用[19-20]。关于丙酸对天然牧草青贮品质、有氧稳定性的影响以及丙酸适宜添加浓度筛选的研究较少，因此本试验探究了丙酸添加量对天然牧草青贮品质及有氧稳定性的影响，旨在为提高天然牧草青贮品质及降低其有氧暴露阶段好氧败坏提供理论依据及实践参考。

1 材料与方法1.1 试验材料

青贮原料：天然牧草于2021年8月1日刈割自内蒙古锡林郭勒盟毛登牧场典型草原天然打草场，刈割后用铡刀切为2 cm左右小段，混合均匀，作为青贮原料待用。当地草群结构主要以羊草(Leymuschinensis，占总盖度27.8%)和大针茅(Stipagrandis，占总盖度21.6%)为主,试验区植物群落调查情况具体见表1。

添加剂：丙酸为分析纯，购于上海麦克林生化科技责任有限公司。

表1 试验地植物群落调查表Table 1 Questionnaire of plant communities in experimental sites

1.2 试验设计

试验采用完全随机设计，设对照组和3个不同丙酸浓度添加剂处理组，以天然牧草鲜重为基础，按每包为250 g的标准，以0 mL·kg-1，2 mL·kg-1，4 mL·kg-1，6 mL·kg-1添加量为分组依据。称取对应量的丙酸，分别加10 mL蒸馏水混合均匀后喷施至称量好的青贮原料中，各处理组命名为：0 mL·kg-1丙酸添加组(CK)、2 mL·kg-1丙酸添加组(T1)、4 mL·kg-1丙酸添加组(T2)、6 mL·kg-1丙酸添加组(T3)。每个处理设置6个重复，其中3个重复用于有氧稳定性的测定。将处理好的样品装入聚乙烯袋中，用塑封机进行真空包装后置于室温下保存，发酵60 d后开袋取样测定青贮饲料的营养品质、发酵品质、微生物数量及有氧稳定性。

1.3 测定指标与方法

1.3.1营养品质 干物质(Dry matter，DM)含量采用烘干法进行测定[21]，将青贮样品置于电热鼓风干燥箱105℃杀青30 min后于65℃烘干48 h，准确称量，计算干物质含量；粗蛋白质(Crude protein，CP)含量采用杜马斯燃烧法进行测定[21]；可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrates，WSC)采用蒽酮-硫酸比色法进行测定分析[22]；酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber，ADF)和中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber，NDF)含量采用ANKOM全自动纤维分析仪进行测定[23]。粗脂肪(Ether extract，EE)采用索氏脂肪提取法测定[24]；粗灰分(Crude ash，Ash)利用灼烧法进行测定[25]。

1.3.2发酵品质 青贮样品开袋后，称取10 g样品于聚乙烯无菌拍打袋中，加入90 mL无菌蒸馏水，使用拍打式无菌均质器拍匀后过滤，滤液置于50 mL离心管内，用于pH值、微生物数量、有机酸及氨态氮的测定。pH值采用便捷式pH计进行测定[26]；乳酸(Lactic acid,LA)、乙酸(Acetic acid,AA)、丙酸(Propionic acid,PA)、丁酸(Butyric acid,BA)采用高效液相色谱仪测定[27]；氨态氮采用苯酚-次氯酸钠比色法测定[28]。

1.3.3微生物数量 微生物数量采用平板计数法测定[29]，将上述滤液按10倍稀释法依次稀释为10-1，10-3，10-5，测定青贮饲料中乳酸菌(Lactic acid bacteria)、一般好氧性细菌(Aerobic bacteria)、大肠杆菌(Coliform)、酵母菌(Yeasts)和霉菌(Molds)数量。其中乳酸菌在MRS固体培养基35℃厌氧培养48 h后计数；一般好氧性细菌在营养琼脂培养基35℃培养48 h后计数；大肠杆菌在伊红美蓝琼脂培养基35℃培养48 h后计数；酵母菌和霉菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基35℃培养48 h后计数。所有微生物数据采用lg cfu·g-1of FM表示。

1.3.4有氧稳定性 青贮饲料开袋后，将青贮饲料约250 g混匀后放入1 L聚乙烯无菌罐中，插入多通道温度记录仪探头，测定青贮饲料温度和环境温度变化，当青贮饲料中温度高于环境温度2℃时说明青贮饲料发生了腐败变质[30]。

1.4 数据统计与分析

数据前期采用Excel 2019软件进行初步处理，采用SAS9.4软件进行单因素方差分析，并用Duncan法对各处理的均值进行多重比较，以P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析2.1 青贮原料营养品质分析

由表2可知，天然牧草青贮原料DM含量为51.21%，ADF与NDF含量分别为35.06%，68.55%，WSC与CP含量分别为6.38%，8.30%，EE含量为2.79%，Ash含量为5.30%。乳酸菌含量较低，为0.54 lg cfu·g-1FW，一般好氧性细菌含量为7.14 lg cfu·g-1FW，酵母菌和霉菌含量均为3.77 lg cfu·g-1FW，青贮原料中未检测出大肠杆菌。

表2 天然牧草原料营养品质及微生物数量Table 2 Nutritional quality and microbial quantity of natural forage raw materials

2.2 丙酸浓度对天然牧草青贮营养品质的影响

由表3可知，CK的DM含量显著低于T2与T3 (P<0.05),而与T1的DM含量无显著差异；T1与T3的CP含量显著高于CK (P<0.05)，而T2的CP含量与CK无显著差异；T3的NDF含量显著低于其余各组(P<0.05)；T1与T2的ADF含量均显著低于CK (P<0.05)，而T3处理组ADF含量与CK无显著差异；T1的Ash含量显著高于CK (P<0.05)，而T2与T3的Ash含量与CK无显著差异；与CK相比，各丙酸浓度处理组WSC含量均显著提高(P<0.05)，且T2与T3的WSC含量显著高于T1(P<0.05)。

表3 不同丙酸浓度对天然牧草青贮营养品质的影响Table 3 Effects of different propionic acid concentrations on nutrient quality of natural forage silage

2.3 丙酸浓度对天然牧草青贮发酵品质的影响

由表4可知，各丙酸浓度处理组pH值均显著低于CK(P<0.05)，在T1中为最低；各丙酸浓度处理组乳酸含量均高于CK，其中T1中乳酸含量显著高于其他处理组(P<0.05)；乙酸含量在T1与T3中均高于CK，在T2中低于CK；在T2与T3中检测到少量丙酸，在CK与T1中均未检测到丙酸；在各处理组中均未检测到丁酸；各处理组的氨态氮：总氮含量均无显著差异。

表4 不同丙酸浓度对天然牧草青贮发酵品质的影响Table 4 Effects of different propionate concentrations on fermentation quality of natural forage silage

2.4 丙酸浓度对天然牧草青贮微生物数量影响

由表5可知，各丙酸浓度处理组乳酸菌数量均显著高于CK(P<0.05)，其中T1达最大值，为5.34 lg cfu·g-1；各丙酸浓度处理组一般好氧性细菌数量均显著低于CK(P<0.05)，其中T3达最小值，为4.38 lg cfu·g-1；各丙酸浓度处理组大肠杆菌数量均显著低于CK(P<0.05)，其中T3达最小值，为4.04 lg cfu·g-1；各丙酸浓度处理组酵母菌数量均低于CK，其中T3显著低于CK(P<0.05)，为4.47 lg cfu·g-1；各处理组中均未检出霉菌。

表5 不同丙酸浓度对天然牧草青贮微生物数量的影响Table 5 Effects of Different Concentrations of Propionic Acid on Microbial Population in Natural Forage Silage

2.5 丙酸浓度对天然牧草青贮有氧稳定性的影响

不同丙酸浓度对天然牧草青贮有氧稳定性的影响评价结果如图1所示，CK处理组、T1处理组、T2处理组、T3处理组天然牧草青贮发生有氧变质时间分别为156 h，268 h，302 h，286 h，T1处理组、T2处理组、T3处理组天然牧草青贮有氧稳定性时间较CK处理组分别提高了71.79%，93.59%，83.33%。

图1 不同丙酸浓度对天然牧草青贮有氧稳定性的影响Fig.1 Effects of different propionate concentrations on aerobic stability of natural forage silage

3 讨论3.1 丙酸浓度对天然牧草青贮营养品质的影响

天然牧草青贮是保障我国牧区畜牧业稳定发展的关键，可使天然草地的牧草得以充分利用，同时使牧区家畜在冬季能够采食到鲜绿饲草，有效保留牧草营养价值。优质青贮饲料一般具有较高的CP含量和较低ADF与NDF含量。天然牧草因生长在特殊的环境且为混合草群，导致乳酸菌数量附着较少、WSC含量较低、含水量较低、缓冲能值较高，直接青贮很难成功[31]。本研究发现，天然牧草青贮中添加不同浓度丙酸使CP含量均有提高。刘庭玉等[32]以赤峰市草甸草原天然牧草为原料，添加有机酸添加剂甲酸青贮后发现CP含量较对照组提高了60%以上，因为甲酸的加入能够快速降低天然牧草青贮饲料pH值，抑制不良微生物对CP的分解，降低CP的流失，这与本研究结果相似，说明有机酸添加剂可以较好的保存青贮饲料的CP；添加不同浓度丙酸均使DM含量高于CK，其中T2与T3显著高于CK，丙酸的添加抑制了不良微生物的生长，保存了发酵底物，使干物质损失率降低，这与李平等[33]研究结果一致；添加不同浓度丙酸均使青贮饲料中WSC含量提高，这与张静等[34]研究结果一致，因为添加丙酸能够抑制一些有害微生物的活性，如酵母菌、霉菌等，使它们对WSC的消耗减少，同时为乳酸菌的发酵提供更多的底物[35]，促进乳酸发酵；添加不同浓度丙酸均不同程度降低天然牧草ADF和NDF含量，这与Zhang[36]的研究结果不同，可能是原料特性不同导致，本研究中ADF和NDF含量降低原因可能是青贮发酵过程中细胞壁组分的酶解和酸解共存的结果[16]。李茂等[37]在木薯叶青贮中加入了丙酸添加剂，结果表明ADF含量与NDF含量均显著降低，与本研究结果一致。说明添加丙酸可以一定程度避免青贮饲料中营养的流失，保存天然牧草青贮饲料的营养价值。

3.2 丙酸浓度对天然牧草青贮发酵品质的影响

优质青贮饲料应具有较高乳酸含量的同时具有较低的pH值。低pH值有助于青贮饲料在厌氧储存期间保持稳定的条件。本研究发现，各丙酸浓度处理组与CK相比，均显著降低了pH值、增加乳酸含量，这是因为丙酸可以有效地抑制有害微生物的生长繁殖，从而使天然牧草青贮过程中乳酸菌成为优势菌种，产生大量的乳酸与乙酸以使pH值显著降低，提高发酵品质。李平等[38]在老芒麦(Elymussibiricus)青贮中添加丙酸后发现其pH值、ADF含量降低，乳酸含量增加，这与本研究结果一致，说明丙酸能够改善青贮饲料发酵品质。而添加过量丙酸可能抑制乳酸菌对WSC的利用，导致T2，T3中乳酸含量较T1降低。与对照组相比，各添加剂处理组均不同程度的提高了乙酸含量，其中T3乙酸含量最高，乙酸含量在各处理组均高于乳酸含量，可能是因为天然牧草表面附着乳酸菌大多为异型发酵乳酸菌，从而产生了大量乙酸。在T2与T3中检测到了丙酸，而在T1中未检测到丙酸，由于丙酸具有强挥发性，可能是在试验初期青贮制作时，在喷施添加剂过程中挥发了部分丙酸，导致添加浓度最低的T1未检测到丙酸含量。在CK处理组未检测到丙酸，而在T2，T3处理组中检测到较多量的丙酸，说明大部分丙酸是由外源添加产生，而少量的是由于天然牧草青贮发酵所产生的发酵产物，这与张静等[34]的研究结果一致。说明在天然牧草青贮中添加丙酸可以有效改善青贮发酵品质。

3.3 丙酸浓度对天然牧草青贮微生物数量及有氧稳定性的影响

青贮饲料中大肠杆菌与酵母菌数量影响着青贮饲料是否发生腐败变质，决定着青贮饲料的有氧稳定性。本研究发现，各处理组有氧稳定时长均高于对照组，Wilkins[39]曾提出青贮饲料中酵母菌数量大于5 lg cfu·g-1FW时，青贮饲料易发生腐败变质，本试验研究发现添加不同浓度丙酸均可以显著降低大肠杆菌与酵母菌数量，使青贮饲料发生有氧变质的概率降低，提高青贮饲料的有氧稳定性。这主要是因为添加丙酸可以使青贮饲料pH值快速下降，酸性环境可以抑制有害菌生长，阻止酵母菌代谢乳酸和WSC。Driehuis等[40]研究发现乙酸与丙酸具有相同作用，也是一种抑制有氧暴露期间青贮饲料酵母菌和霉菌生长有效的物质，能够有效地抑制青贮饲料腐败变质。本试验中天然牧草青贮发酵60 d后不同丙酸浓度处理组均具有较高的乙酸含量，可以抑制酵母菌和霉菌的生长，因而获得了较高的有氧稳定性。青贮原料中附着的乳酸菌含量是决定青贮能否成功的关键，青贮原料乳酸菌附着量越大，青贮越容易成功。一般认为青贮原料中乳酸菌附着含量大于5 lg cfu·g-1FW时，青贮可以具有较好的发酵效果[41]，而本研究中天然牧草青贮原料中乳酸菌附着含量较低，仅为0.54 lg cfu·g-1FW，但在青贮后由于丙酸抑制了不良微生物的生长，创造了利于乳酸菌的生存条件，使乳酸菌迅速繁殖，提高乳酸菌含量，促进青贮发酵[42]，提高天然牧草青贮发酵效果。同时各处理中均未检测到霉菌，说明各处理均具有较好的发酵效果。

4 结论

本试验研究表明，丙酸添加量为2 mL·kg-1，4 mL·kg-1，6 mL·kg-1均能够不同程度的提高天然牧草青贮品质，增加有氧稳定性，减少不良微生物的产生。综合考虑，在实际生产过程中丙酸添加量为2 mL·kg-1即可。