菌剂对高寒地区土壤微生物群落结构及固氮菌群的影响

周 泽， 姚 拓， 史潭梅, 付卫刚， 贺善睦， 杨晓蕾， 高丽珍， 李建宏*

(1.甘肃农业大学草业学院， 草业生态系统教育部重点实验室， 甘肃 兰州 730070； 2.临潭县科学技术局， 甘肃 甘南 747500)

青藏高原是我国重要的生态屏障，它的稳定关乎整个国家的生态环境安全，而农业生态系统是青藏高原生态系统的重要组成部分之一[1]，因其特殊的地理条件，加之人类薄弱的耕地保护意识,土壤连年耕作，过量施用化肥，出现了肥料增产效应降低、土壤贫瘠、退化、稳定性差等现象[2]。有数据表明，氮肥利用率仅为29.1%～39.0%[3]。

植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是一类具有固氮、溶磷、解钾、分泌植物激素和拮抗植物病害等作用的有益微生物[4]。在植物中施用不同的优良植物根际促生菌研制的复合微生物菌剂，不仅具备以上促生特性，还能减少因生产化肥造成的非再生能源的消耗[5]。因此，近些年有学者尝试利用植物根际促生菌制剂替代部分化肥，并取得了良好的效果[6-7]。荣良燕等[8]在玉米(ZeamaysL.)中施用菌剂，减少了20%～30%的化肥施用量，同时实现玉米增产9.86%。李永斌等[9]发现施加菌剂后，在减少10%的尿素使用量下，还能使小麦(Triticumaestivum)增产10.4%。张万通等[10]在高寒草地施用菌剂部分代替化肥，发现在减少化肥的施用量的同时，还缓解了因施氮肥引起的物种丰富度下降的情况。目前关于PGPR替代化肥方面研究，主要集中于替代量的选择、根际土壤养分的变化、植物生长的改变等方面[11-12]。PGPR菌剂发挥作用，不仅可以通过代谢作用增加有效养分的含量，还能在一定程度上改善土壤微生态环境，从而发挥促生作用[13]。因此，要全面认识PGPR替代化肥的效果，就要了解施用PGPR菌剂对土壤微生物的影响。然而对高寒耕作区中菌剂部分替代化肥对土壤微生物影响的报道较少。

磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid,PLFA)是活体微生物细胞膜恒定组分,它对环境因素比较敏感、能在生物体外迅速降解，特定菌群PLFA数量改变可反映原位土壤真菌、细菌的活体生物量以及微生物菌群结构的变化[14]。因此，本研究在青藏高原耕作区使用菌剂与化肥配施，通过分析土壤磷脂脂肪酸，测定土壤中自生固氮微生物数量、脲酶和硝态氮等指标。初步探究微生物菌剂部分替代化肥之后土壤微生物群落结构及固氮菌群的变化，以期为高寒草地微生物菌剂的推广使用提供理论依据。

1 材料与方法1.1 研究区概况

试验于2019年在甘南藏族自治州临潭县新城镇进行。样地位于甘肃省东南部、甘南藏族自治州东部(34°30′～35°05′ N，103°10′～103°52′ E)，属高山丘陵地区，地势西高东低，平均海拔高度2 825 m，年平均气温为3.2℃，最高温度29.6℃，最低温度-27.1℃，相对无霜期65 d，绝对无霜期10 d[15]，年降水量383.2～668.2 mm，年平均日照时数2 324 h，属高寒阴湿区，是典型的高原农业区[16]。

1.2 试验设计

试验共设置5个处理，每个处理3次重复。试验各小区面积为25 m2，各小区之间设1.5 m隔离带，隔离带中不施肥。试验地种植植物为青稞(Hordeumvulgarevar.celesteLinnaeus)，品种为藏青，种子来源于当地农资市场。无机化肥与菌剂施加量分别为45 kg·hm-2，300 kg·hm-2。供试微生物菌剂由甘肃农业大学草业学院提供(具体配方正在申请专利中)，主要菌株为蕈状芽孢杆菌Bacillusmycoides Gnyt1(保藏号：CCTCCM 2017177)、枯草杆菌BacillussubtilisLHS11和假单胞菌Pseudomonassimiae240，菌剂有效活菌数≥1×109cfu·mL-1。无机化肥为磷酸二胺，总养分(N+P2O5)≥64.0%，购买自当地农资市场。处理1为单施化肥(T1)、处理2为菌剂+75%化肥(T2)、处理3为菌剂+50%化肥(T3)、处理4为菌剂+25%化肥(T4)、处理5为单施菌剂(T5)，空白对照(CK)为不施肥。在土壤表层0～10 cm取样，去除杂物，装入无菌样品采集袋中，带回实验室-80℃保存，用于土壤微生物磷脂脂肪酸等分析。

1.3 土壤微生物PLFA测试

土壤微生物PLFA测试方法为气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)法，样品主要处理流程为提取、分离、酯化[17]。主要试剂为37种脂肪酸混标(FAME)(Supelco,USA)和26种脂肪酸混标(BAME)(Supelco,USA)。GC-MS分析色谱柱采用Agilent Technologies公司的HP-5MS(60 m，250 mm)。具体步骤为140℃，3 min，以每分钟4℃升温至190℃。190℃，1 min，然后以每分钟3℃升温至230℃，230℃下1 min，之后再以2℃每分钟升温至250℃，1 min后，最后以10℃每分钟升温至280℃，280℃，1 min。离子源EI+，MS Scan模式全扫描(范围50～500)[18]。磷脂脂肪酸采用Frostegard[19]方法命名，PLFA可以作为微生物生物量和群落结构变化的生物标记分子[20]，微生物生物量用各PLFA含量加和表示[21]。磷脂脂肪酸(PLFA)分类结果见表1。

表1 特征磷脂脂肪酸分类Table 1 Classification of phospholipid fatty acids (PLFA) Signature

1.4 土壤指标测定

土壤微生物量氮测定采用氯仿熏蒸K2SO4浸提法。浸提液中的土壤微生物量氮采用凯氏定氮法，每个土样重复3次测定[24]。使用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定土壤脲酶活性[25]。铵态氮测定采用氯化钾浸提-靛酚蓝比色法(氯化钾浓度为2 mol·L-1,土水比为1∶5)，土壤硝态氮测定采用双波长紫外分光光度校正因数法，测定结果均以土壤干质量计算[26]。

1.5 土壤自生固氮菌的计数

好气性自生固氮菌使用改良阿须贝(Ashby)无氮琼脂培养基，以平板表面涂布法测定[27]，嫌气性自生固氮菌使用玉米面培养基，以稀释法测定[28]。

1.6 统计分析

采用Excel 2019进行数据统计计算并绘图，使用R语言(3.5.1)对土壤微生物指标进行相关性分析，SPSS 26.0软件对数据进行One-Way ANOVA统计分析和Duncan极差法进行差异显著性检验,数据为平均值±标准误。

2 结果与分析2.1 不同施肥处理下土壤微生物群落结构

2.1.1土壤微生物组成 由表2可知，随菌剂替代化肥的比例增加，土壤中细菌数量逐步增加，各处理间差异显著(P<0.05)。真菌与放线菌数量变化趋势同细菌相似，整体呈上升趋势，都随菌剂替代化肥的比例增加而增加。土壤总PLFA表示土壤中总微生物量，随菌剂替代化肥的比例增加，土壤总PLFA也呈现上升趋势，T1-T5之间差异显著。(P<0.05)。

表2 不同施肥处理土壤微生物组成Table 2 Soil Microbial Composition in Different Fertilization Ratios

2.1.2土壤微生物群落结构 施用菌剂对土壤微生物群落结构也产生了影响。GP整体呈上升趋势，T5处理下，GP数值最高，CK与T5(单施菌剂)处理之间差异不显著。GN变化趋势随菌剂替代化肥比例增加而增大，CK与T5之间无显著差异。GP数量始终大于GN数量，GN/GP呈上升趋势，除CK外，其余处理之间差异显著(P<0.05)。B/F呈下降趋势，随菌剂替代化肥的比例增加，B/F值变小，除CK外，各处理之间差异显著(P<0.05)(表3)。

表3 不同施肥处理下土壤微生物群落结构Table 3 Soil microbial community structure under different fertilization ratios

2.1.3土壤微生物压力指数 随菌剂替代化肥比例的增加，微生物压力指数减小。T1(单施化肥)、T2(菌剂+75%化肥)、T3(菌剂+50%化肥)与CK相比，差异显著(P<0.05)。T4(菌剂+25%化肥)、T5与CK之间无显著差异。化肥施用比例增加，微生物压力指数增大，说明化肥增加了土壤微生物的胁迫程度，导致土壤微生物压力指数增大。

2.2 土壤好气与嫌气自生固氮菌群数量

由图2可知，菌剂替代化肥的比例增加之后，土壤中自生固氮菌数量也相应增加。T1与CK处理下，自生固氮菌数量较少，同施用菌剂相比，差异显著(P<0.05)。随菌剂的比例增大，好气性自生固氮菌数量变多，嫌气性自生固氮菌总体呈增加趋势。土壤中好气性自生固氮菌数量大于嫌气性自生固氮菌。施用菌剂后，好气性自生固氮菌数量增加更加明显。T4处理下，好气性自生固氮菌数较T1处理增长40.07%，嫌气性自生固氮菌增长11.11%。T5与CK处理相比较，自生固氮菌数量差异显著(P<0.05)。单施化肥处理下自生固氮菌数量小于不施肥处理。

图1 不同施肥处理下微生物压力指数Fig.1 Microbial Pressure Index under Different Fertilization Ratios注：误差线为标准误。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同Note:The error line is standard error. Different lowercase letters indicate distinct differences,the same as below

图2 不同施肥处理下好气性与嫌气性自生固氮菌数量Fig.2 Number of Aerobic and Suspicious Azotobacter under Different Fertilization Treatments

2.3 土壤酶活性与氮含量

由表4可知，随菌剂替代化肥比例增加，土壤脲酶活性随之升高，CK脲酶活性最低，脲酶活性在T4处理下达到最大值，为0.42 mg·(g·d)-1。微生物量氮随菌剂比例的增加，呈先上升后下降的趋势，在T4处理时出现峰值(9.32 mg·kg-1)。CK处理下微生物量氮含量最低。硝态氮与铵态氮变化趋势与微生物量氮相似，呈先上升后下降趋势，在T4处理达到最大值，分别为9.66 mg·kg-1，6.84 mg·kg-1。

表4 不同施肥处理下土壤酶活性与氮含量Table 4 Soil enzyme activity and nitrogen content under different fertilization treatments

2.4 不同施肥处理下土壤微生物指标相关性分析

由图3可知，土壤微生物总磷脂脂肪酸与细菌磷脂脂肪酸呈极显著正相关(P<0.01)，与革兰氏阴性菌、真菌和放线菌磷脂脂肪酸呈极显著正相关(P<0.01)。细菌磷脂脂肪酸与革兰氏阴性菌、真菌的磷脂脂肪酸呈极显著正相关(P<0.01)。真菌磷脂脂肪酸与放线菌磷脂脂肪酸呈现极显著正相关(P<0.01)。土壤微生物总磷脂脂肪酸与土壤中微生物的压力指数呈极显著负相关(P<0.01)。革兰氏阴性菌和真菌磷脂脂肪酸与土壤微生物压力指数呈极显著负相关(P<0.01)。

图3 土壤微生物各指标相关性分析Fig.3 Correlation analysis of soil microorganism indexes注:*表示在0.05水平上显著相关；**表示在0.01水平上显著相关；***表示在0.001水平上显著相关。GP,革兰氏阳性菌；Bacteria,细菌；Total PLFA,总磷脂脂肪酸；GN,革兰氏阴性菌；Fungus,真菌；Actinomycete,放线菌；Urease,脲酶；Microbial nitrogen,微生物量氮；Microbial pressure index,微生物压力指数；Nitrate-N,硝态氮；Ammonium-N，铵态氮Note:*means significant correlation at the 0.05 level;**means significant correlation at the 0.01 level,***means significant correlation at the 0.001 level。GP,Gram-positive bacteria；bacteria，bacteria；Total PLFA,total phospholipid fatty acid；GN,Gram-negative bacteria；Fungus,fungus；Actinomycete,actinomycete；Urease,urease；Microbial nitrogen,Microbial nitrogen;Microbial pressure index,Microbial pressure index;Nitrate-N,Nitrate-N,Ammonium-N

3 讨论3.1 菌剂替代化肥对土壤微生物群落结构的影响

土壤磷脂脂肪酸可用来表示土壤微生物的生物量以及微生物群落结构[29]，土壤微生物群落多样性能够检测土壤受干扰后的微小变化，描述微生物群落结构的变化和自然或人为干扰对群落的影响[30]。试验表明，对施用菌剂后的土壤进行PLFA测试分析发现，提高菌剂替代化肥的比例，土壤总磷脂脂肪酸增加。说明施用菌剂提高了土壤中细菌、真菌、放线菌的数量，且差异显著。菌剂中微生物为筛选得到的具有促生能力的优良菌株，施用于土壤中，能明显增加土壤中有益微生物的数量，致使土壤中微生物量碳、氮和磷的含量增加，微生物量碳、氮和磷也是植物能够吸收利用养分的主要来源之一[31]。在保证作物产量的同时，使用菌剂替代部分化肥，能减少过量施用化肥带来的不良后果。CK中微生物数量与全施菌剂处理下微生物总数差异不显著，但CK中好气性自生固氮菌与嫌气性自生固氮菌数量远小于全施菌剂(T5)处理。土壤中有益微生物数量占土壤总微生物数量的主体地位时，土壤才会向良性方向发展[32]。在养护条件相同的情况下，作物的产量能直接体现土壤的肥力大小。土壤的营养状况还可以通过革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌之间的比值来反映，比值越高表明营养胁迫程度越低[23]。本研究发现，提高菌剂替代化肥的比例之后，革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌比值先升高后降低，在T4处理下达到峰值。说明施用一定量的菌剂能显著改善土壤的营养状况。菌剂替代化肥的比例降低之后，土壤微生物的数量也随之减少，可能是化肥在一定程度上改变了土壤微生物的群落结构，致使微生物数量下降。增加菌剂替代化肥的比例，土壤微生物数量增加，这对于土壤肥力的保持，减少化肥的危害量具有重要的意义。细菌与真菌数量的比值表示土壤中两个群落的相对丰度，能够体现土壤生态系统对外界缓冲能力，该指标越低，表明生态缓冲能力越高[33]，施用菌剂之后土壤的缓冲能力显著提高。说明施用菌剂能提高土壤的抗性，增强土壤应对胁迫的能力。土壤微生物压力指数反映土壤中微生物所受的胁迫程度，本试验中随菌剂替代化肥的比例增加，微生物压力指数减小。说明施用菌剂有利于土壤微生物的生长繁殖，会减少土壤微生物的生存压力。这与杨淑娜[34]等人的研究结果相同，使用有机肥料或菌肥替代部分化肥，减少了微生物压力指数，增加了土壤有机质，从而提升了土壤肥力。

3.2 菌剂替代化肥对固氮菌群、土壤酶活性与氮含量的影响

固氮菌能够利用自身分泌的固氮酶，将空气中的N2转化为可利用的氮素[35]。土壤中自生固氮菌能够增加土壤中的氮素，从而减少氮肥的施用量。提高菌剂替代化肥的比例，好气性自生固氮菌数量与嫌气性自生固氮菌数量较CK均出现显著增加，且各处理间差异显著(P<0.05)。说明施用菌剂能够提高土壤中固氮微生物的数量，进而增加土壤中氮的含量。由此可见，施肥中增加菌剂或者有机类肥料的施用比例，减少无机化肥的施用，对土壤自身肥力的持续形成具有重要意义。土壤酶在土壤各种养分转化之间发挥着重要作用，酶活性的大小能间接衡量土壤肥力[36]。脲酶是土壤酶中一类关键的水解酶，其活性能体现出土壤对植物的供氮能力大小。脲酶在土壤的氮素循环过程中有着不可替代的作用，是土壤中物质转化与能量代谢的必需物质。土壤微生物数量及土壤有机质的含量能够决定土壤中脲酶的活性[37]。在土壤中施用菌剂或有机肥能够提升土壤中脲酶的活性[38]，本试验中，提高了菌剂替代化肥的比例，脲酶的活性相应增加。菌剂中的微生物能够增加土壤有机质，使土壤酶免遭变性或降解，间接增加了土壤脲酶的活性，这也与高佳等人[39]的研究结果相似。土壤微生物量氮能够体现出土壤中的氮素含量大小[40]。硝态氮和铵态氮是土壤中的氮素形态之一，含量较低，但却能够被植物直接吸收利用，所以土壤中硝态氮与铵态氮含量能反映出土壤肥力的大小[41-42]。通过试验发现，随菌剂替代化肥比例的增加，土壤微生物量氮先增加后减小，在替代75%化肥处理下，土壤微生物量氮、硝态氮以及铵态氮含量最大。说明在保证土壤养分的同时，使用部分菌剂替代化肥，能有效减少化肥的危害。张万通[10]等人在高寒草地施用菌剂发现，过高比例的菌剂施用，不会增加土壤中氮素的含量。因此，菌剂并不能完全替代无机化肥，在前人的研究结果中也能得到相应的佐证[43]。后续的研究中，应对菌剂的配方进行进一步的优化，依据土壤的需要，增加菌剂中大量元素或者微量元素的含量，更加有效的提升土壤肥力，以便能减少化肥的施用比例。也应该对土壤的肥力进行进一步的评价，如通过监测增加菌剂施用比例或不施肥情况下，作物产量的变化趋势等。

4 结论

不同处理下菌剂对土壤微生物群落结构与固氮菌群有显著影响，菌剂+25%化肥处理下，不仅增加了土壤总磷脂脂肪酸，还显著提高了土壤中好气性自生固氮菌与嫌气性自生固氮菌数量；相较于单施菌剂处理，菌剂+25%化肥处理下土壤脲酶活性，以及硝态氮、铵态氮和微生物量氮含量最高，但总PLFA与固氮有益菌数量略低于单施菌剂处理。综上，菌剂并不能完全替代化肥，但菌剂的施用在提升了土壤肥力的同时，还改善了土壤微生态环境，减少了农药化肥的使用，间接降低化肥农药带来的危害，以及由化肥农药的施用带来的食品污染与不可再生能源的消耗。