检测燕麦干草主要营养成分含量的近红外光谱分析模型

王 储， 麻冬梅， 李 跃， 屈新月， 李智林， 胡倩楠， 乔葭月， 孙 彦*

(1. 中国农业大学草业科学与技术学院， 北京 100093； 2. 宁夏大学生态环境学院， 宁夏 银川 750021)

燕麦(Avenasative)是一种优良的禾本科(Gramineae)饲草，具有较高的营养价值与饲用价值，可改善粗饲料的消化利用率，是家畜重要的饲料来源，对缓解家畜矛盾、提供均衡饲料、维持草地畜牧业可持续发展和生态建设均起到了至关重要的作用[1-3]。燕麦干草适口性好，具有可消化纤维含量高以及钾和硝酸盐含量低等特点，可提高家畜的生产性能外，还能降低在某些时期疾病的发病率，例如降低奶牛产后酮病的发生。燕麦干草的营养品质主要取决于粗蛋白(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)和粗脂肪(EE)含量，而且易受品种、产地、收获时期、加工方式等因素的影响[4-7]。目前国内对牧草营养指标的测定普遍采用常规的化学测定方法，具有准确度和精确度高等优点，但存在周期长、成本高、局限性强和操作麻烦等缺点，不能实时监测，此外，检测使用危险的化学药品，对检测员与环境也会造成一定的危害。

近红外光谱分析是一种能够快速估测样品中一种或多种化学成分含量的新技术，其关键特征是对有机化学物质在其近红外光谱区内光学特性的利用，并且具有定量分析，可连续进行样品分析，为饲料品质快速鉴定、常规营养成分快速检测和饲料产地溯源等提供了技术途径[8-11]。近红外光谱属于分子振动光谱类型，其本质又是非谐振动的倍频和组合频。由于每个分子都会有许多吸收带，并且吸收带的强弱为近红外分析样品浓度，物理性质(如密度、粘度、粒度、硬度等)和化学成分(如蛋白质、氨基酸、脂肪、淀粉、水分等)提供了可能。理论上说，凡能产生近红外光谱的物质，都可用近红外光谱技术进行分析检测。近年来，近红外在紫花苜蓿(Medicagosativa)、黑麦草(Loliumspp.)、玉米秸秆中营养品质的测定得到广泛的运用[12-14]，其中，纳嵘等[15]通过采集94份苜蓿样本结合最小二乘法，使用4种数学处理方法与5种散射校正方法对原始光谱进行处理建立苜蓿干草常规营养成分含量的近红外模型，然而，在燕麦干草主要营养成分含量分析上国内鲜有人报道。近红外技术本身属于一种间接检测技术，在实际运用中需要采集大量具有代表性的样本，除此之外样品来源、收获时期和生产年限都会使建立的模型产生差异，因此研究应用NIRS快速、准确测定不同年限不同收获时期以及不同品种的燕麦干草中粗蛋白(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维含量(ADF)和粗脂肪(EE)含量的方法，对我国饲草行业的发展和提供优质牧草，起到了关键的作用。

1 材料和方法1.1 样品采集与处理

试验样品采自2020—2021年宁夏平罗-宁夏大学试验地种植的燕麦种质资源，品种分别来自中国、美国、加拿大，于拔节、抽穗、开花、乳熟和完熟期进行齐地刈割收获，每个小区随机采集5株。在60℃下烘干至恒重，剪碎，混匀、用康源鑫KF-25(温州)高速粉碎机进行粉碎，然后过1 mm的筛，得到249份燕麦全株干草样品。试验技术路线图如图1所示。

图1 模型构建流程图Fig.1 Model construction flow chart

1.2 数据处理与分析

采用定标软件WinISI III和EXCEL 2019对数据进行处理与分析。

1.3 近红外光谱数据的获取和处理

本试验采用FOSS公司生产的NIRSsystem500型近红外光谱仪，工作条件为室温26℃，扫描波长范围1 100 ～2 492.8 nm，波长间隔2 nm，扫描次数32次计算平均光谱。

为了消除仪器和环境的干扰，提高信噪比，进行光谱预处理，采用无散射预处理(None)、标准化处理(SNV)、去趋势化处理(Detrend)、SNV+ Detrend、标准化多元散射处理(SMSC)、加权多元散射处理(WMSC)、反向多元散射处理(IMSC)等处理方法；数学处理包含导数处理和平滑处理；回归方法包括改进局部偏最小二乘法(MPLS)、偏最小二乘法(PLS)、主成分回归(PCR)。

1.4 燕麦干草营养分含量(品质)的检测

燕麦干草中粗蛋白质(CP)含量参照GB/T 6432—2018方法(KDY-9830凯氏定氮仪)测定；中性洗涤纤维(NDF)含量参照GB/T 20806—2006方法(ANKOM 2000i 全自动纤维分析仪)测定；酸性洗涤纤维(ADF)含量参照NY/T 1459—2007方法(ANKOM 2000i 全自动纤维分析仪)测定；粗脂肪(EE)含量参照GB/T 6433—2006方法(DFA-2型分布式脂肪测定仪)。每个样品指标重复测定3次，取平均值作为最终化学分析测定值，所有营养成分含量均以干物质为基础。

1.5 建立NIRS定量分析模型方法

近红外分析的样品包括定标集和验证集，定标集样品中尽可能包括那些最高、最低范围内的样品。将剔除异常值后的所有样品为定标集，再做交叉验证并用验证记进行外部验证，根据RSQ,RMSEC,RMSECV,RMSEP和RPD等指标确定最优模型。建立模型后对随机选取35个样品(验证集)进行预测，并将预测值与真实值进行检验判定预测结果与真实值的差异来评价模型预测能力。

2 结果与分析2.1 燕麦干草CP，NDF，ADF和EE的化学分析结果

图2是249份燕麦干草样品中CP，NDF，ADF和EE的化学分析结果。含量范围分别是4.50%～12.30%，43.40%～57.10%，18.22%～44.50%，4.60%～15.30%。由图2可见样品中这4个指标的含量变化幅度大，符合正态分布，样品来源广泛，其变化范围基本上覆盖当前生产上不同生育时期推广品种和品种选育中可能出现的CP，NDF，ADF和EE的含量，可用于建立燕麦干草主要营养成分的近红外光谱校正模型。

图2 燕麦草常规养分含量测定值Fig.2 Measued value of conventional nutrient contents of oat grass

2.2 燕麦干草的光谱图分析

图3是249个燕麦样品的近红外漫反射光谱图曲线，从中可以看出近红外区内燕麦干草的光谱反映很好，每个样品的吸收波段很相似却不会完全重合，这表明不同样本之间的重现性良好，又存在差异。样品之间的差异也有可能是因为不同样品表面的粗糙程度不同、电噪声和操作的影响，所以需要进一步对光谱进行预处理。仪器噪音即使用者操作失误等均会产生奇异样本，使整个分析数据的结果受到影响。本次试验的聚类算法采用主成分分析(PCA)，并利用马氏距离法(GH>3)和T检验(T>2.50)剔除异常值，发现并剔除6个异常样本，最终得到243份燕麦干草样品的光谱图用来建立预测燕麦干草品质的近红外模型。

图3 燕麦干草原始光谱Fig.3 Oat hay raw spectrum

2.3 CP，NDF，ADF和EE近红外校正模型的建立与优化

本试验通过定标软件WinISI III分别对CP，NDF，ADF和EE定标集的243个燕麦干草样品进行最佳光谱处理和最优数学处理方法以及最适合的回归方法的筛选。建立校正标准误差和交叉验证误差最小，定标相关系数最大的校正模型。得到了CP，NDF，ADF和EE的最佳近红外建模数据。采用MPLS分别对经过不同光谱和数学预处理后的光谱进行建模分析，并通过交叉验证的方式进行预测，具有最低的SEC、SECV和最高的RSQ和1-VR模型为最优模型。

表1是CP与EE的定标相关系数和交叉验证系数分别为0.97和0.92,0.91和0.83，校正标准误和交叉验证误差分别为0.00和0.00,0.01和0.01，逼近化学分析的精确度。另外NDF与ADF的建模效果较CP和EE差，定标相关系数和交叉验证系数分别为0.86和0.79,0.83和0.79，校正标准误和交叉验证误差分别为0.02和0.02,0.01和0.01，接近化学分析的精确度。

表1 燕麦干草主要营养成分含量的最优定标模型Table 1 Optimization results for the calibration of CP,NDF,ADF and EE

2.4 CP，NDF，ADF和EE近红外校正模型预测效果评价

为了进一步检验校正模型的优劣，本次试验采用验证集样品对模型的预测效果进行评价，衡量参数选用RSQv外部验证决定系数，RMSEP预测标准误差，RPD预测相对标准误差。根据Sinnaeve、Park和何云的报道，当RPD(SD/RMSESV)大于2.50时模型能用于近红外预测[12,16-17]，大于3.00时模型具有较好的预测效果，小于2.00时，定标模型受到限制，不能用于预测。由表2看出CP,ADF,NDF,和EE的外部验证决定系数和预测标准误差分别为0.96和0.01,0.90和0.00,0.84和0.00,0.95和0.00。其中CP,NDF和EE的预测相对标准误差均大于3说明具有很好的预测效果，ADF的预测相对标准误差相对较小但是大于2.50，可以用于近红外预测。除此之外，由散点图4-7所示，比较化学值与预测值之间的差异，发现他们之间相关系数分别为0.96，0.90，0.84，0.95，均在0.83以上，表明预测值与真实值之间比较接近有很好的预测效果，可以应用此模型对未知的燕麦干草样品中的CP,ADF,NDF和EE的含量进行实际预测。

表2 燕麦干草主要营养成分含量的最优定标模型的预测效果评估Table 2 Evaluation of prediction effect of optimal calibration model for main nutrient content of oat hay

图4 CP测定值与预测值的相关性Fig.4 Correlation between measured and predicted value of CP

图5 NDF测定值与预测值的相关性Fig.5 Correlation between measured and predicted value of NDF

图6 ADF测定值与预测值的相关性Fig.6 Correlation between measured and predicted value of ADF

图7 EE测定值与预测值的相关性Fig.7 Correlation between measured and predicted value of EE

3 讨论3.1 NIRS模型测定燕麦干草品质的可行性

本试验中所采集的燕麦干草样品分别来自不同地区、年限、生长期，并且样品的常规养分含量变化幅度大，覆盖面广泛，时间跨度较长，有利于NIRS模型的构建与优化；样品间的离散程度大符合正态分布，表明所选样品分布广泛，且具有良好的代表性。NIRS与化学分析方法联用，包括光谱预处理、变量选择、数学处理、多元校正和模型转移，一定程度上能够提高模型预测的准确性和可靠程度[18]。为了进一步优化模型，人们采用NIRS与多元线性回归法(MLR)、主成分回归法(PCR)、改进偏最小二乘回归法(MPLS)和偏最小二乘回归法(PLS)相结合使预测的结果更为可靠[19-20]。本试验在建立燕麦干草品质鉴定近红外预测模型中，对不同营养成分含量对应的光谱图进行了不同预处理以及数学处理，在此基础上再结合MPLS分析，将燕麦干草的光谱图和对应的通过化学分析方法测定的燕麦干草营养指标进行关联，通过交叉验证评价模型预测效果，最终得到准确度较高的CP,NDF,ADF和EE含量的4个预测模型。目前关于近红外在燕麦干草品质分析中应用的报道较少，关于燕麦干草中EE含量的预测，更是罕见或者预测结果不太理想[21-23]。本次试验建立的模型具有以下特点：样品来源分布广，品种数目多，收集于不同生长时期和年限，分析结果更加全面,因此本试验建立的模型效果表明NIRS技术可用于分析燕麦干草品质。

3.2 影响NIRS校正模型建立的因素

近红外作为一种通过光谱间接检测的技术，存在许多影响准确性的因素，其受到影响的因素可概括为以下几点：(1)样品的储存环境；(2)收获时期；(3)来原产地；(4)茎叶比；(5)样品的状态；(6)化学分析结果的准确性；(7)光谱的处理方法对测定结果的影响[24-28]。本研究中为了避免样品的状态、储存环境影响，采用统一烘干，重复取样，选取光谱平均值的方法，来消除影响。关于化学分析测定均参照国家标准，并进行多次重复测定来降低误差。本试验通过不同光谱处理、数学处理和回归方法的组合挑选适宜的预处理方法来减少和消弱非目标因素对光谱的影响，此外本次试验对燕麦微量元素的测定还没有涉及，为进一步提高模型的准确性和适用性，应在今后的研究中进一步扩大样品数量，增加测定指标，加强样品的代表性以及获取更多的准确数据来完善模型的应用。

4 结论

本试验利用了NIRS分析技术建立了燕麦干草品质的近红外预测模型。其中CP,NDF和EE含量预测模型的定标系数均(RSQ)和外部验证决定系数(RSQv)均在0.83以上，校正标准误(SEC)、交叉验证误差(SECV)和预测标准误差(RESEP)均小于0.02，RPD均大于3，具有很好的预测效果，达到化学分析的精确度，ADF含量预测模型的定标系数均和外部验证决定系数分别为0.83和0.84，校正标准误(SEC)、交叉验证误差(SECV)和预测标准误差(RESEP)均小于0.01，接近化学分析精度，预测相对标准误差(RPD)相对较小但是大于2.50。所有模型均可用于实际检测中且适应良好，其中CP，NDF，EE含量的定标模型效果更为精确和可靠。