硒引发对不同品种紫花苜蓿种子抗氧化特性的影响

王 勃， 王聪聪， 夏方山， 陈奕霖， 赵 萍， 朱慧森

(山西农业大学草业学院， 山西 太谷 030801)

硒是对人类和动物身体健康至关重要的必需微量元素，其含量不足会导致机体免疫下降和内分泌失调等多种关联疾病的发生[1]。由于硒在人类和动物体内无法自发合成且易于排泄，因此人类和动物必须以食物链中的硒作为摄入来源，以保障其生命机体的正常代谢活动[2]。然而，土壤中硒可利用性低，导致人体硒含量低，这成为一个全球性的公共卫生问题[3]。我国土壤缺硒地区约占国土总面积的72%，且严重缺硒地区约占1/3[4]。因此，解决土壤缺硒问题是当前我国乃至全球关注的热点问题。通过合理的生物富硒既能提高植物的产量和品质，又能增加人类和动物体内硒水平，从而成为提高人类硒摄入水平的关键途径[5-6]。研究发现，喷施硒肥能够促进玉米(Zeamays)[4]、黑小麦(Triticumaestivum)[6]、水稻(Oryzasativa)[7]等植物生长发育，并提高其籽实产量和硒含量等品质。然而，过量喷施硒肥会抑制植物的生长发育，并造成其产量下降[8]。因此，合理控制硒浓度是富硒农产品生产的关键环节[9]。

当前，采用土壤施肥和叶面喷施是农业生产中植物微肥的主要施用方式，而采用种子引发方式则较少[10]。土壤施肥因微肥需求量少而难以均匀撒施，叶面喷施则无法快速缓解根系对微肥缺乏的敏感需求，两者又均对人力物力的需要较大，这都降低了微肥施用的经济效益，种子引发则可避免这些局限性[11]。种子引发不仅能提高植物的产量和品质，还能增强植物在逆境条件下的抗氧化能力，抑制其脂质过氧化作用的发生，从而提高其抗逆性[12]。硒引发同样既能促进植物的生长发育，又能通过提高其抗氧化能力来增强其抗逆性能[13-14]。因此，种子引发被作为一种经济有效、简单可行、备受关注的生理策略应用于富硒植物生产[3,15]。然而，硒引发对植物的影响研究仍然较少，致使不同植物种或品种对其响应差异仍不清楚，这严重制约了其在生产实践中的推广应用。

牧草硒含量水平与草食动物机体健康具有密切关系，进而间接决定着人类身体的健康状况[16]。紫花苜蓿(Medicagosativa)因适应性强、产量高、再生快、富含优质蛋白质等诸多特性被作为优质牧草在世界各地广泛种植[17-18]。研究发现，日粮中添加富硒苜蓿草粉既能够促进家畜增重，又可提高其饲料转化率和肉品质[16]。因此，如何更好地生产富硒苜蓿产品也就日益被农牧业领域所关注。研究发现，适量浓度的硒引发[14]及基施[19]方式也均会提高紫花苜蓿的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(Aseorbate peroxidase，APX)及过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性，并降低了其丙二醛(Maloddialdehyde，MDA)含量，不仅能促进紫花苜蓿种子萌发及幼苗生长[20]，还能提高其不同生育期的营养品质[21-23]。然而，高浓度硒引发则相反[20]，且不同品种紫花苜蓿种子的萌发及幼苗生长能力均随硒浓度增加而降低[2]，但不同品种紫花苜蓿的抗氧化酶能力如何响应硒引发则尚未见报道，这对富硒紫花苜蓿生产中最佳品种的筛选极为不利。因此，本试验以12个紫花苜蓿品种的种子为材料，分析亚硒酸钠溶液引发不同时间后其抗氧化酶活性及脂质过氧化的变化规律，以期揭示不同紫花苜蓿品种响应硒引发的抗氧化性能差异，并筛选出适宜进行硒引发的紫花苜蓿品种，从而为高质量富硒苜蓿产品的生产提供理论指导。

1 材料与方法1.1 材料来源

供试材料是品种为偏关苜蓿，WL168HQ，WL298HQ，WL319HQ，WL343HQ，WL440HQ，WL354HQ，WL363HQ，WL366HQ，WL656HQ，WL712和WL903的紫花苜蓿种子，偏关苜蓿种子由山西农业大学草种实验室在2018年10月收获于校内基地，其他品种的苜蓿种子由北京正道农业股份有限公司于2019年5月提供，均在2018年8月收获于美国爱达荷州，所有种子被获取后均密封保存于种子库(-20℃)内至2020年11月试验进行。

1.2 硒引发处理

将饱满一致的各品种种子分别置于浓度为0.5 mmol·L-1(浓度筛选见参考文献[14])的亚硒酸钠溶液，于20℃条件下浸泡0 h(CK)，3 h，6 h，9 h和12 h后，快速用蒸馏水冲洗3遍，并迅速用干滤纸吸完其种皮表面水分后于25℃黑暗条件自然风干至含水量为10%(鲜重基础)左右。每个处理重复4次。

1.3 发芽试验

发芽条件及发芽率(Germination percentage，GP)的计算参照国际种子检验协会公布的种子检验规程(2018)[24]，末次计数为第10 d，具体操作步骤参照文献[25]。

1.4 生理指标测定

粗酶液参照Kibiza等[26]的方法提取，准确称取1.0 g种子于室温条件下用蒸馏水吸胀4 h后冰浴研磨，上清液于4℃条件保存备用，每个指标的测定均取用0.5 mL粗酶液加入3 mL反应体系内。SOD活性测定参照Rao和Sresty[27]的方法，CAT活性测定参照Aebi[28]的方法，APX活性测定参照Nakano和Asada[29]的方法，谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase，GR)活性测定参照Madamanchi和Alscher[30]的方法，MDA含量测定参照Bailly等[31]的方法，可溶性蛋白含量采用南京建成科技有限公司所生产的试剂盒测定。

1.5 数据统计与分析

以Excel 2010软件进行数据整理，并用SPSS 22.0软件对相同及不同品种紫花苜蓿种子的各指标数据进行单因素方差分析，多重比较(P<0.05)则采用Duncans法进行，最终以平均值±标准误方式表示结果。

2 结果与分析2.1 硒引发对不同品种紫花苜蓿种子发芽率的影响

由表1可知，除WL712发芽率在引发9 h时显著低于引发3和6 h时外(P<0.05)，其他11个品种的紫花苜蓿种子发芽率则随硒引发时间的延长并未发生显著变化。相同引发时间下，不同品种的紫花苜蓿种子GP存在很大差异。引发0 h(CK)时，WL354HQ的GP显著高于WL168HQ，WL712和偏关苜蓿(P<0.05)；引发3 h时，WL354HQ和WL366HQ的GP显著高于WL712，WL903HQ和WL440(P<0.05)；引发6 h时，WL343HQ和WL363HQ的GP显著高于WL712(P<0.05)；引发9 h时，WL366HQ，WL298HQ和WL319HQ的GP显著高于WL712和偏关苜蓿(P<0.05)；引发12 h时，WL354HQ的GP显著高于WL656HQ，WL712和WL903HQ(P<0.05)。

表1 硒引发对不同品种紫花苜蓿种子发芽率的影响Table 1 Effects of selenium priming on germination percentage of different alfalfa varieties 单位：%

2.2 硒引发对不同品种紫花苜蓿种子超氧化物歧化酶活性的影响

由表2可知，随硒引发时间的延长，偏关苜蓿种子SOD活性逐渐升高；WL168HQ，WL366HQ和WL440的SOD活性呈先升高后下降的趋势，均在引发3 h时达到最大值；其余品种的SOD活性则逐渐下降。未引发(CK)时，WL712，WL319HQ和WL903HQ的SOD活性显著高于其他品种(P<0.05)，而WL168HQ和偏关苜蓿的SOD活性显著低于其他品种(P<0.05)；引发3 h时，WL712，WL903HQ和WL440的SOD活性显著高于其他品种(P<0.05)，而WL343HQ的SOD活性则显著低于其他品种(P<0.05)；引发6 h时，WL712和偏关苜蓿的SOD活性显著高于其他品种(P<0.05)，而WL343HQ的SOD活性仍显著低于其他品种(P<0.05)；引发9 h时，偏关苜蓿的SOD活性仍显著高于其他品种(P<0.05)，而WL343HQ，WL366HQ和WL440的SOD活性则显著低于其他品种(P<0.05)；引发12 h时，偏关苜蓿的SOD活性显著高于其他品种(P<0.05)，而WL363HQ，WL298HQ和WL712的SOD活性则显著低于其他品种(P<0.05)。

表2 硒引发对不同品种紫花苜蓿种子SOD活性的影响Table 2 Effects of selenium priming on SOD activity of different alfalfa varieties 单位：U·mg-1 protein

2.3 硒引发对不同品种紫花苜蓿种子过氧化氢酶活性的影响

由表3可知，随硒引发时间的延长，偏关苜蓿的CAT活性逐渐升高；WL319HQ，WL903HQ和WL354HQ的CAT活性逐渐下降，其余品种的CAT活性则呈先升高后下降的趋势，WL366HQ，WL656HQ和WL712在引发3 h时达到最大值，而WL343HQ，WL363HQ，WL168HQ，WL298HQ和WL440则在引发6 h时达到最大值。未引发(CK)时，WL903HQ的CAT活性显著高于其他品种(P<0.05)，而偏关苜蓿和WL656HQ的CAT活性则显著低于其他品种(P<0.05)；引发3 h时，WL168HQ和WL366HQ的CAT活性显著高于其他品种(P<0.05)，而偏关苜蓿的CAT活性则仍显著低于其他品种(P<0.05)；引发6 h时，WL168HQ，WL298HQ和WL440的CAT活性显著高于其他品种(P<0.05)，而偏关苜蓿的CAT活性仍显著低于其他品种(P<0.05)；引发9 h时，WL168HQ和WL298HQ的CAT活性仍显著高于其他品种(P<0.05)，而WL656HQ和偏关苜蓿的CAT活性则显著低于其他品种(P<0.05)；引发12 h时，WL298HQ的CAT活性仍显著高于其他品种(P<0.05)，而WL656HQ的CAT活性则仍显著低于其他品种(P<0.05)。

表3 硒引发对不同品种紫花苜蓿种子CAT活性的影响Table 3 Effects of selenium priming on CAT activity of different alfalfa varieties 单位：U·min-1·mg-1 protein

2.4 硒引发对不同品种紫花苜蓿种子抗坏血酸过氧化物酶活性的影响

由表4可知，随硒引发时间的延长，偏关苜蓿种子APX活性逐渐升高；WL298HQ，WL712，WL440和WL354HQ的APX活性呈先升高后下降的趋势，WL298HQ在引发3 h时达到最大值，WL712和WL440在引发9 h时达到最大值，而WL354HQ则在引发6 h时达到最大值；其余品种的APX活性则逐渐下降。未引发(CK)和3 h时，WL319HQ的APX活性显著高于其他品种(P<0.05)，而偏关苜蓿的APX活性则显著低于其他品种(P<0.05)；引发6 h时，WL440的APX活性显著高于其他品种(P<0.05)，而WL343HQ，WL363HQ，WL168HQ，WL366HQ和偏关苜蓿的APX活性均显著低于其他品种(P<0.05)；引发9 h时，WL440的APX活性仍显著高于其他品种(P<0.05)，而WL366HQ的APX活性也仍显著低于其他品种(P<0.05)；引发12 h时，WL440的APX活性仍显著高于其他品种(P<0.05)，而WL168HQ和WL366HQ的APX活性则显著低于其他品种(P<0.05)。

表4 硒引发对不同品种紫花苜蓿种子APX活性的影响Table 4 Effects of selenium priming on APX activity of different alfalfa varieties 单位：μmol·min-1·mg-1 protein

2.5 硒引发对不同品种紫花苜蓿种子谷胱甘肽还原酶活性的影响

由表5可知，随硒引发时间的延长，WL343HQ，WL363HQ和WL656HQ的GR活性逐渐下降，其余品种的GR活性则呈先升高后下降的趋势，WL168HQ，WL712，WL319HQ，WL903HQ，WL440和WL354HQ在引发3 h时达到最大值，而WL366HQ，WL298HQ，WL903HQ和偏关苜蓿则在引发6 h时达到最大值。未引发(CK)时，WL319HQ的GR活性显著高于其他品种(P<0.05)，而WL168HQ，WL712，WL298HQ和偏关苜蓿的GR活性则显著低于其他品种(P<0.05)；引发3 h时，WL440的GR活性显著高于其他品种(P<0.05)，而WL343HQ和WL363HQ的GR活性则显著低于其他品种(P<0.05)；引发6 h时，WL366HQ的GR活性显著高于WL319HQ和WL903HQ以外的品种(P<0.05)，而WL343HQ的GR活性仍显著低于其他品种(P<0.05)；引发9 h时，WL354HQ的GR活性显著高于其他品种(P<0.05)，而WL343HQ和WL363HQ的GR活性则显著低于其他品种(P<0.05)；引发12 h时，WL354HQ的GR活性仍显著高于其他品种(P<0.05)，而WL712的GR活性显著低于WL343HQ，WL168HQ，WL656HQ和WL903HQ以外的品种(P<0.05)。

表5 硒引发对不同品种紫花苜蓿种子GR活性的影响Table 5 Effects of selenium priming on GR activity of different alfalfa varieties 单位：U·min-1·mg-1 protein

2.6 硒引发对不同品种紫花苜蓿种子丙二醛含量的影响

由表6可知，随硒引发时间的延长，偏关苜蓿种子的MDA含量呈先升高后下降的趋势，其余11个品种的MDA含量均呈升高的趋势。偏关苜蓿的MDA含量在引发3 h时达到最大值，WL168HQ外的其余品种则在引发12 h时达到最大值。引发0(CK)～12 h时，偏关苜蓿的MDA含量均显著低于其他品种(P<0.05)；未引发(CK)时，WL903HQ，WL168HQ和WL366HQ的MDA含量显著高于其他品种(P<0.05)；引发3 h时，WL903HQ的MDA含量均显著高于其他品种(P<0.05)；引发6 h时，WL903HQ的MDA含量显著高于其他品种(P<0.05)；引发9 h时，WL903HQ和WL354HQ的MDA含量仍显著高于其他品种(P<0.05)；引发12 h时，WL354HQ的MDA含量显著高于其他品种(P<0.05)。

表6 硒引发对不同品种紫花苜蓿种子MDA含量的影响Table 6 Effect of selenium priming on MDA content of different alfalfa varieties 单位：μmol·mg-1 protein

3 讨论

适宜的硒处理能够促进植物种子的萌发及其幼苗生长[3,20]。张士敏等[32]研究不同硒源及浓度对偏关苜蓿种子萌发的影响时也发现了这一现象。然而，本试验中，硒引发下12个品种的紫花苜蓿种子GP与CK相比并未发生显著变化，这与彭琪等[33]的研究结果相似，可能是因为硒引发促进了种子内蛋白质、多糖及核糖等大分子贮藏物质的分解，为其萌发过程的细胞快速分裂提供了充足的能量基础和物质保障[34]。因此，利用硒引发进行富硒苜蓿草产品生产时，本试验中12个品种的紫花苜蓿没有发生因田间出苗率下降而造成减产的现象。

硒被认为是直接参与动植物体内抗氧化等多种代谢反应的重要微量元素[35]，适宜的硒处理能提高紫花苜蓿[14]、黑小麦[34]、遏蓝菜(Thlaspiarvense)[36]及生菜(Lactucasativa)[37]等植物的抗氧化性能。本试验中，12个品种紫花苜蓿种子的SOD，CAT，APX及GR活性在引发3～6 h时仍保持较高活性，这可能是短时间(3～6 h)的硒引发下其SOD活性仍保持较高水平，产生并积累了大量的H2O2，从而诱导了其CAT，APX和GR活性升高[38]，因而其MDA含量也增加幅度相对较小，这与低浓度的硒引发对水稻[3]、紫花苜蓿[14,19]和生菜[37]等植物抗氧化性能的影响相似。然而，植物适应硒的生理活性范围往往相对较窄，过量或缺乏均会对植物的生理代谢产生负面影响[35,38]。本试验中，除偏关苜蓿外，其余11个品种的CAT，SOD，APX和GR活性在硒引发12 h时均已下降，这可能是H2O2的过量积累[3,38]以及硒非特异性地结合了蛋白质[39]，从而造成了其细胞膜系统的脂质过氧化损伤，表现为MDA含量均显著高于CK(P<0.05)，WL343HQ，WL363HQ，WL656HQ，WL319HQ和WL903HQ尤为突出，这与水稻[3]、紫花苜蓿[14]和生菜[37]等植物的研究发现相似。尽管引发12 h时，12个品种紫花苜蓿种子的GP均无显著变化，但仅有偏关苜蓿仍保持较高的抗氧化能力，这可能是硒处理对紫花苜蓿种子GP无影响，却会抑制其幼苗生长的原因[33]，因而说明不同品种紫花苜蓿种子的耐硒能力存在很大差异[2]，除偏关苜蓿外的紫花苜蓿品种已不适宜继续进行硒引发。代惠萍等[40]也发现，不同品种紫花苜蓿叶片SOD，CAT，APX和POD活性存在显著差异，大叶苜蓿的抗氧化能力最高，而维多利亚最差，这与本试验现象类似。因此，不同品种紫花苜蓿的抗氧化能力对硒引发的响应存在差异，在其富硒生产应用中应谨慎选择品种，本试验研究对象中以偏关苜蓿品种最适宜用于富硒苜蓿产品的生产。

4 结论

外源硒引发对12个品种紫花苜蓿种子的发芽率基本无显著影响，但对其抗氧化能力的影响存在明显差异。短时间(3～6 h)硒引发时，大多数紫花苜蓿种子保持较高的抗氧化能力，而除偏关苜蓿外，其余11个品种的抗氧化能力均在长时间(12 h)硒引发时显著降低(P<0.05)，因而偏关苜蓿最适宜采用引发技术进行富硒草产品生产，而WL343HQ，WL363HQ，WL656HQ，WL319HQ和WL903HQ则最不适宜。