自然老化和人工老化对燕麦种子萌发特性及遗传完整性的影响

黄 颖， 刘 欢， 赵桂琴， 王绮玉， 罗建民， 姚瑞瑞

(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心, 甘肃 兰州 730070)

皮燕麦(AvenasativaL.)和裸燕麦(AvenanudaL.)均为禾本科燕麦属(AvenaL.)一年生草本植物[1]，前者为粮、饲兼用的世界型栽培植物，成熟时内外稃与籽粒不易分离；后者又称玉麦、莜麦、铃铛麦，为绿色营养保健作物，籽粒易与外稃分离[2]。随着我国畜牧业的发展，燕麦种植面积逐年扩大，种子需求量也随之增加，然而种子自生理成熟即发生不可逆的劣变，严重影响了生产、育种中种质资源的贮藏、开发和利用[3]。

种子老化是一个不可逆的过程，种子活力在生理成熟时达到顶峰，随着贮存时间延长而降低，直至完全丧失。因此，燕麦种质资源的耐贮藏性是决定燕麦种子品质的一个重要因素。自然老化作为衡量燕麦耐贮藏性的直接方式，历时较长，而人工老化历时较短，被广泛应用于种质资源的耐贮藏性研究[4]，但是人工老化是否能够代替自然老化尚存争议。Balesevic等[5]对6个大豆(GlycinemaxL.)品种研究表明人工老化会加速氧化物歧化酶和过氧化物酶活性的下降。高华伟等[6]研究表明人工加速老化与自然贮藏时的大豆种子老化进程有明显的相关性。张雯静等[7]发现自然老化大葱(AlliumfistulosumL.)种子各项活力和生理生化特性下降明显快于人工老化的种子。燕麦种质在人工老化及自然老化保存过程中其群体的遗传结构是否得到完全的保持，种子贮藏、繁殖保存中发生的老化及劣变是否导致遗传变异，对成功贮存种子具有重大的意义[4]。

简单序列重复区间扩增多态性分子标记(Inter-simple sequence repeat，ISSR)最早是由Zietkiewicze等[8]在SSR的基础上建立起来的，利用植物基因组自身SSR设计引物扩增重复序列间的区域，无需预先进行克隆和测序[4]，是一种简单、可靠、高效、易于处理、应用广泛的DNA指纹技术[9]，近年被广泛应用于遗传多样性和遗传完整性分析中。刘欢等已建立且优化燕麦ISSR体系[10]。目前，国内外利用ISSR分子标记技术开展了关于水稻(OryzasativaL.)[11]、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)[12]和李(PrunussalicinaL.)[13]等多种植物种质资源的遗传完整性研究。石凤玲等[12]利用ISSR分子标记技术探究不同老化种子的发芽率与其遗传完整性变化的关系，发现75.00%可以考虑作为紫花苜蓿种子繁殖更新的发芽率标准。本研究通过探讨不同老化方法对不同燕麦种质的贮藏过程中萌发特性，利用ISSR分子标记分析老化对遗传物质的影响和差异，为制定适合燕麦种质资源的保存和更新策略提供科学依据，并确定燕麦种质资源的更新标准。

1 材料与方法1.1 试验材料

供试的皮燕麦品种为陇燕3号，裸燕麦品种为白燕2号，由甘肃农业大学草业学院提供，各处理方案见表1，自然老化种质材料收获于2012—2018年，贮藏仓库室内全年通风，年均温保持在10℃～12℃、年平均相对湿度为45%～64%，试验于2020年10月在甘肃农业大学草业学院实验室进行，供试材料分别贮藏了2年、4年、6年和8年。

表1 燕麦种子的自然老化和人工老化处理Table 1 Treatment of Avena seeds under natural aging and artificial aging

参照郑晓鹰提供的老化方法[14]，测定燕麦种子初始含水量，将2018年收获的燕麦种子含水量调至10%～14%，置于人工老化箱中，设定温度为45℃，相对湿度95%进行人工老化。设置老化时间为24～96 h，每24 h取样一次，共4个处理，以2018年收获的未经人工老化的种子为对照(Control check，CK)。老化完毕，取出种子晾至含水量降为原状态，在4℃冰箱保存。

1.2 试验方法

1.2.1测定指标与方法 按照《国际种子检验规程》规定[15]，采用培养皿纸上法进行发芽试验，并逐日统计种子发芽数。

发芽率=发芽种子数/供试种子数×100%

活力指数(VI)=∑Gt/Dt×S

式中：Dt为发芽天数，Gt为Dt相应(t天)的发芽数，S为幼苗鲜重(g)。

浸出液电导率：随机数取每品种50粒净种子，浸入100 mL去离子水并封口，以去离子水为空白对照;于25℃恒温培养箱中放置24 h；浸种结束，立即测定溶液电导率[15]。

1.2.2燕麦种子基因组DNA提取 采用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP305)提取燕麦种子DNA。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外分光光度计测定DNA纯度，于-20℃冰箱保存。

1.2.3ISSR-PCR反应体系和ISSR引物的筛选 参照哥伦比亚大学公布的100条ISSR通用引物序列及刘欢[10]、郭红媛[16]和余青青[17]等已发表的关于研究燕麦ISSR遗传多样性的文章，选出20条ISSR引物(表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。ISSR-PCR反应体系总体积为25 μL：12.5 μL 2× San Taq PCR Mix、40 ng模板DNA、4 μL引物(10 μmol·L-1)，用ddH2O补充至25 μL。在PCR热循环仪器上进行PCR扩增，扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。扩增结束后，用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，点样5 μL，以天根生化科技(北京)公司的2 000 bp Marker为对照，1×TAE为电泳缓冲液，电压90 V，电流80 mA，电泳1 h，用Bio-Rad凝胶成像系统拍照保存。

表2 20条ISSR引物信息Table 2 Information on the 20 pairs of ISSR primers

1.3 数据统计与分析

利用Excel 2010,NTSYS 2.1,POPGENE 32及SPSS 20.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析2.1 自然老化和人工老化对燕麦发芽率的影响

随着老化处理时间的增加，2个燕麦品种的发芽率总体呈下降趋势(图1)。贮藏2～4年的陇燕3号发芽率差异不显著，均高于85.00%，随后逐年下降，贮藏8年降至60.00%；而贮藏2年的白燕2号发芽率为90.50%，随后降幅逐年增大，贮藏8年发芽率降至49.00%。与自然老化相比，经人工老化的陇燕3号发芽率显著下降(P<0.05)，各处理均与CK差异显著(P<0.05)，AL1发芽率较CK下降了71.35%；随着人工老化进程加深，白燕2号发芽率呈先升后降的趋势，人工老化处理24 h的种子发芽率为91.00%，略高于CK，经人工老化处理72 h后发芽率显著下降(P<0.05)，经人工老化处理96 h降至54.00%。由此看来，自然老化对白燕2号的发芽率影响更大，人工老化对陇燕3号发芽率影响更大。

图1 自然老化和人工老化对燕麦种子发芽率的影响Fig.1 Effect on germination ratio of Avena under natural aging and artificial aging

2.2 自然老化和人工老化对燕麦种子活力指数的影响

随着老化时间的增加，种子活力指数总体呈下降趋势(图2)。自然老化对白燕2号种子活力指数影响显著，贮藏2年的白燕2号种子活力指数显著高于陇燕3号(P<0.05)；随着贮藏时间的延长，自然老化下的陇燕3号的活力指数下降不显著，而白燕2号种子活力指数降幅逐年增大，贮藏8年的白燕2号种子活力指数降至4.16，略低于陇燕3号。经人工老化处理24 h的燕麦种子与CK相比下降显著(P<0.05)，随着人工老化时间的增加，白燕2号种子活力指数的降幅逐渐增大(P<0.05)，陇燕3号则下降较为缓慢。

图2 自然老化和人工老化对燕麦种子活力指数的影响Fig.2 Effect on vigor index of Avena under natural aging and artificial aging

2.3 自然老化和人工老化对燕麦种子细胞膜透性的影响

随着老化时间的增加，燕麦种子浸提液电导率总体呈上升趋势(图3)。不同老化方法下白燕2号的电导率均高于陇燕3号，自然老化下陇燕3号的电导率增长缓慢，贮藏8年的陇燕3号电导率与对照差异显著(P<0.05)；自然老化下白燕2号的电导率总体呈先下降后上升的趋势，白燕2号种子贮藏4年，电导率开始显著上升(P<0.05)，贮藏8年的白燕2号细胞透性增大，电导率增至47.13 μS·cm-1。人工老化对陇燕3号种子电导率影响不显著；经人工老化24 h的白燕2号电导率显著高于CK，人工老化24 h后上升缓慢；2种供试燕麦在人工老化96 h后电导率差异达到最大，陇燕3号的电导率仅为白燕2号的40.22%。

图3 自然老化和人工老化对燕麦种子电导率的影响Fig.3 Effect on electrical conductivity of Avena under natural aging and artificial aging

2.4 种子基因组DNA质量和纯度检测

用于分子标记的燕麦种子DNA，条带清晰，OD260/OD280介于1.8～2.0，DNA纯度较好，没有杂质污染。老化处理对DNA分子量无明显变化，条带无明显降解现象(图4)。

图4 自然老化和人工老化下燕麦的基因组DNA图谱Fig.4 The genomic DNA of Avena under natural aging and artificial aging

2.5 自然老化和人工老化下燕麦种子ISSR-PCR多态性及其直观分析

由表3可知，自然老化和人工老化下2个燕麦品种的种子基因组DNA由不同ISSR引物扩增出的条带数不同(8～16条)，10条引物共检测出108个位点，多态性位点85个，总多态性位点达78.70%。

表3 ISSR引物扩增结果及其多态性Table 3 Amplification results and polymorphism of ISSR primers used in this study

通过POPGENE 32对基因多样性指数分析表明(表4)，L(自然老化的陇燕3号群体)的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、基因多样性(H)、香农指数(I)值均为最高，分别为1.225 2，1.164 0，0.093 5和0.136 1。与L群体相比，AL，B和AB的Na，Ne，H和I均有所下降，各群体遗传参数排序均为L > AL > B > AB。可见，人工老化对2个燕麦品种遗传物质的损伤比自然老化更大。

表4 应用ISSR标记对4个处理群体的遗传参数分析Table 4 ISSR Genetic parameters analysis of four different treated populations

对不同老化处理下燕麦种子群体的基因组DNA进行ISSR-PCR扩增，引物UBC885和引物UBC889可以较为明晰的展示燕麦种子老化处理前后较为ISSR-PCR图谱变化(图5)。引物UBC885扩增出来的燕麦种子基因组片段长度主要集中在100～750 bp的范围内，陇燕3号种子经人工老化后条带逐渐模糊，大分子条带逐渐变暗，小分子条带变亮且伴有条带增加现象；引物UBC889扩增片段长度主要集中在100～2 000 bp的范围内，白燕2号经人工老化处理48 h和72 h后，在250～500 bp出现特有带。从扩增图谱来看，随着老化时间的延长，部分小分子条带逐渐变淡，100～500 bp出现DNA片段的缺失和增加现象，且DNA片段的缺失和增加都是随机的，这种现象在人工老化下更为明显。

图5 引物UBC885(上)、UBC889(下)对自然老化和人工老化处理燕麦种子的ISSR-PCR图谱Fig.5 ISSR amplification patterns of UBC885(upper) and UBC889(below) primers to different aging populations of Avena under natural aging and artificial aging

2.6 老化处理下燕麦种子与对照间的遗传相似性

各老化处理间遗传相似系数(表5)表明，自然老化各处理均与对照差异不显著；人工老化各处理与对照间遗传相似系数最大的是24 h的处理，遗传相似系数为0.864 9，最小的是处理96 h，遗传相似系数为0.681 2。人工老化低于48 h的处理与对照间的遗传相似系数差异不显著，人工老化处理72 h种子受到的伤害较大，与对照之间的遗传相似系数差异显著(P<0.05)，可见人工老化处理的临界值介于48～72 h。人工老化对燕麦种子遗传特征的影响大于自然老化。

表5 不同老化时间燕麦与对照间的遗传相似系数Table 5 The genetic similarity coefficient between aging treatments and control treatments of Avena under different aging time

2.7 老化处理下燕麦种子ISSR标记的聚类分析

NTSYS分析16份老化燕麦材料间遗传相似系数(GS)结果表明，其变化范围为0.504 5～0.973 0(表6)。老化处理下燕麦种子ISSR标记的聚类分析如图6所示，在遗传相似系数0.800 0时聚为两大类，陇燕3号和白燕2号的种子老化材料分别聚为一类。陇燕3号各处理在遗传相似系数为0.855 0时，自然老化处理(L1，L2，L3和L4)和人工老化处理(AL1，AL2，AL3和AL4)各归为一类，在遗传相似系数为0.930 0，人工老化处理中AL4单独聚为一类。白燕2号在遗传相似系数为0.880 0聚为两类，第一类为自然老化处理(B1，B2，B3和B4)，第二类是人工老化处理(AB1，AB2，AB3和AB4)。最终，在最高遗传相似系数0.980 0时，仅AL2和AL3聚为一类。可见，不同品种的燕麦遗传距离差异较大，同一品种在不同老化方法下遗传相似度较低；长时间(≥72 h)的高温高湿老化对陇燕3号和白燕2号种子的遗传完整性保持具有较大的负面作用。

表6 自然老化和人工老化下燕麦的遗传相似系数Table 6 The Genetic coefficient of the oat samples under natural aging and artificial aging

图6 基于ISSR分子标记的燕麦老化种子材料聚类分析Fig.6 Cluster analysis of aged oat seeds based on ISSR marker

3 讨论

种子活力是检验种子质量的重要指标之一，种子萌发是种子活力的具体表现，高活力的种子具有更好的生长优势，生产潜能和耐贮藏性[18]。本研究中影响燕麦种子萌发的主要因素为自然老化与人工老化处理的时间。随着贮藏时间和人工老化的延长，陇燕3号和白燕2号种子活力均呈明显的下降趋势，相对电导率上升，这与大豆[6]和水稻[11]的相关研究结果一致。人工老化处理24 h的白燕2号种子发芽率略高于未老化处理，这可能与种子休眠有关，燕麦属于非深度休眠植物，贮藏年限较短的种子存在休眠或生理后熟现象，而短时间内温度升高可能激活了种子内部某些酶的活性[19]，从而提高了种子发芽率。自然老化和人工老化下陇燕3号种子活力指数明显低于白燕2号种子，这可能是因为陇燕3号是皮燕麦，其外稃的机械约束作用在一定程度上延迟了种子的发芽时间。

人工老化因其耗时短、便于操作和可重复性高等优点被广泛应用于牧草种子耐贮性的相关研究。许多试验表明，人工老化和自然老化的老化进程有一定的相关性，但也有研究表明，人工老化和自然老化两种老化进程的遗传基础不同[20]。遗传参数分析显示：人工老化群体的遗传参数较自然老化群体有所下降。由此看来，人工老化对燕麦种子遗传物质的损伤比自然老化更大，这可能由于人工老化更易导致燕麦种质群体的部分等位基因缺失，降低其遗传完整性，推测人工老化不能完全代替自然老化进行种子的耐贮性研究。当前我国种质资源保存工作的核心是维持种质资源的遗传完整性，即贮藏和繁殖更新过程中保持最小的遗传变异，维持等位基因频率分布的稳定和群体的基因频率分布以及遗传结构完整[21]。自然老化和人工老化下燕麦种子ISSR-PCR图谱显示：随着贮藏时间和高温高湿老化处理时间的延长，条带趋于模糊，且伴有条带数目减少和增加，说明老化时间的延长会引起遗传变异。方青慧等[22]发现老化使燕麦种子中醇溶蛋白含量降低，也证实了老化对燕麦的遗传完整性具有负面影响。在美洲狼尾草(PennisetumglaucumL.)[23]、水稻[11]和扁蓿豆(MedicagoruthenicaL.)[24]的遗传完整性研究中也发现种子老化会降低种质资源的种子活力，染色体畸变增多，同时伴随着遗传完整性的下降[25]。

种子老化会引起染色体畸变和DNA损伤，破坏基因组的完整性，为了保持种质资源遗传完整性，必须考虑更新种质资源库的临界发芽率[26]。目前，各国种质资源更新的临界发芽率的标准不尽相同，如印度的临界发芽率标准为75.00%[27]，英国为70.00%，美国为50.00%[28]，而我国牧草中心库将更新种质资源库的临界发芽率定为60.00%[29]。本研究中贮藏时间不超过4年的2个燕麦品种的种子及人工老化0～48 h的白燕2号发芽率均高于84.00%，可以保持较高的遗传多样性，而人工老化72 h，遗传完整性显著下降，此时白燕2号发芽率降至79.50%。由此看来，陇燕3号和白燕2号的贮藏时间应保持在1～4年，不宜超过6年，据此推测应试燕麦品种的发芽率临界值在79.50%～84.00%。人工老化下陇燕3号各处理发芽率均低于30.00%，完全丧失了种用价值，建议采用高温高湿老化方法对该种质进行耐贮性研究时将老化时间缩短在24 h内。未来寻找燕麦种质资源更新的具体临界发芽率和相应的种质资源贮存时间，还需要细化种子老化的时间梯度，将形态学、细胞学、生理生化研究相结合，采取更加先进的技术，并对遗传参数进行更深入的分析。

4 结论

随着老化程度加深，2个燕麦品种的种子活力和遗传完整性逐渐降低。陇燕3号比白燕2号更耐贮，人工老化对种子遗传物质的损伤比自然老化更大，可见其不能完全替代自然老化。高温高湿老化处理白燕2号种子的临界值介于48～72 h，贮藏时间不超过4年的陇燕3号和白燕2号种子及人工老化0～48 h的白燕2号种子发芽率均高于84.00%，可以保持较高的遗传多样性，人工老化72 h后白燕2号种子发芽率降至79.50%，与未经人工老化处理的种子遗传相似系数差异显著，说明应试燕麦种质的发芽率临界值介于79.50%～84.00%之间，建议将陇燕3号和白燕2号的贮藏时间保持在1～4年，不宜超过6年。