贵州岩溶山区野生天蓝苜蓿根瘤菌资源发掘、固氮特性及其多样性研究

曾庆飞， 韦兴迪， 韦 鑫， 欧二绫， 吉玉玉， 舒健虹， 龙忠富

(贵州省农业科学院草业研究所, 贵州 贵阳 550006)

贵州是位于我国西南部的一个唯一没有平原支撑的低纬度高原山区省，也是喀斯特地貌发育最强烈、分布面积最大的典型区域。地势、海拔差异和丰富的降雨量，形成了贵州极为明显的立体气候特征和植物种类的丰富多样性[1]。贵州境内生长着多种天然野生豆科牧草，其中天蓝苜蓿(Medicagolupulina)在全省范围内广为分布[2]。

天蓝苜蓿是苜蓿属一年生或越年生的优良野生草本植物，具有适应性广、抗逆性强、匍匐生长、耐践踏性好并能通过共生固氮提高土壤肥力等诸多优良特性，同时还是一种适口性好、粗蛋白含量高、粗纤维含量低的优质饲用牧草[3]。国内外针对天蓝苜蓿的研究主要集中在地理分布、生物学特性及其在建植草坪绿地、护坡固土等栽培应用[4-6]，以及不同地区天蓝苜蓿根瘤菌的系统发育、多样性和宿主专一特性等方面。我国已有西北地区[7]、西藏林芝地区八一镇[8]、云南部分地区[9]以及部分尾矿区[10-11]的天蓝苜蓿根瘤菌系统发育和多样性的研究报道。在贵州地区，林家栋等[2]对全省天蓝苜蓿野生资源作过系统调查，统计结果显示，省内从罗甸县海拔520 m的低热河谷地区到威宁县海拔2 600 m的高寒地带均有野生天蓝苜蓿的分布，但是针对环境特殊且资源丰富的贵州岩溶山区天蓝苜蓿根瘤菌尚缺乏具体的研究。

豆科植物与根瘤菌共生结瘤系统的有效形成是基于根瘤菌与豆科植物的相互识别与匹配，植物与根瘤菌之间存在着相对专一的共生范围[12]；这一共生范围受自然生态与地理环境的影响和控制，根瘤菌与豆科植物的共生关系因区域地理环境的差异而表现出不同的多样性特征[13]。

本文从采自贵州省不同生态功能区域的野生天蓝苜蓿根瘤样品中分离、纯化根瘤菌株，进行分子生物学鉴定及区系分布特征分析；并选择来自不同地域、不同种类的天蓝苜蓿根瘤菌，采用盆栽回接方法，结合菌株固氮酶活性的测定，筛选结瘤固氮能力强、植物促生效果好的优良根瘤菌株，以期探明贵州野生天蓝苜蓿根瘤菌的资源特异性，并为地区农业及草地生态畜牧业的可持续发展，为喀斯特生态环境的重建与修复，提供可利用的共生微生物资源和研究基础。

1 材料与方法1.1 试验材料

1.1.1根瘤样品 34份野生天蓝苜蓿根瘤样品(置入变色硅胶管)采自贵州省黔东南、黔东北、黔北、黔西南和黔南地区19个县(市)的4个不同生态功能区[14]，具体采集地点及根瘤样品编号见图1。

图1 野生天蓝苜蓿根瘤样品编号及采集地点Fig.1 Root nodule sample numbers of wild Medicago lupulina and their sampling sites注：审图号GS(2021)5448号；图例中空白框代表没有采集过样品的区域Note:Drawing No. GS(2021)5448；The blank box in legend represented regions where no samples were collected

1.1.2牧草种子盆栽回接试验 用百脉根(Lotuscorniculatus)种子(品种名：歌德)购于贵阳霖卉园林绿化有限公司。

1.2 根瘤菌株的分离纯化

将采集到的天蓝苜蓿根瘤样品用清水冲净，吸水纸吸干表面水分后用无菌水浸泡过夜至吸胀状态。挑取10～20颗硕大饱满的单个根瘤放入无菌小烧杯中，用95%的酒精浸泡5 min，再换用0.1%的HgCl2继续浸泡5 min，无菌水洗涤5～l0次；转至无菌研钵中加入1 mL无菌水研磨，用移液枪将研磨液转至加有刚果红的酵母甘露醇琼脂(Yeast mannitol agar,YMA)平板上，均匀涂布，28℃培养箱内恒温倒置培养3～7 d，3 d后每天观察1次。挑取菌落圆形、表面光滑隆起、略透明或半透明、湿润黏稠、不吸色、边缘整齐的典型单菌落，用平板划线法接种于另一新的YMA平板上，28℃恒温倒置培养，长出菌落后挑取单菌落用于革兰氏染色镜检，直至获得纯化菌株。将纯化菌株接种至YMA液体培养基中，28℃振荡培养7 d后用30%甘油保种，-70℃超低温冰箱中冻存。

1.3 根瘤菌株的鉴定与区系分析

1.3.1根瘤菌株的形态学鉴定 参照《微生物分类学》中原核细菌的鉴定方法[15]，对纯化后染色镜检为红色的革兰氏阴性(G-)菌株进行菌体形状、荚膜和鞭毛有无等形态特征的观察。其中菌体形状在革兰氏染色鉴定时直接观察；菌体荚膜采用石碳酸复红染色液初染、黑色素复染方法，油镜观察菌体荚膜的有无(菌体呈红色，荚膜无色，背景灰色或黑色)；鞭毛采用硝酸银鞭毛染液染色法，油镜观察菌体鞭毛的有无(菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色)。

1.3.2根瘤菌株的16S rRNA基因序列比对 采用北京百泰克生物技术有限公司的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取各菌株的总DNA，选用16S rRNA基因扩增通用引物对P1-P6扩增各菌株的16S rDNA片段；将纯化回收的PCR产物与质粒PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α；提取阳性转化子的质粒DNA，酶切验证后送昆明硕擎生物科技有限公司测序。利用NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)中的Blast软件将测得的各菌株序列分别进行在线比对，同时从GenBank数据库中下载与待分析序列相近的已知种模式菌株的16S rDNA序列，将测得的菌株序列与模式菌株序列利用DNAMAN分析软件进行多重比对后，确定各菌株的种属分类地位。

1.3.3根瘤菌株的区系分析 根据分离菌株的系统发育分析结果，分别对贵州岩溶山区、贵州不同生态功能区中所分离鉴定到的天蓝苜蓿根瘤菌的种属组成、分离频度以及优势种类进行系统分析。分离频度采用微生物区系分析普遍使用的相对频率和绝对频率中的相对频率计算公式分别计算[16]：分离频度(%)=(某个种出现的样品数/总样品数)×100%。

1.4 优良根瘤菌株的盆栽回接筛选

1.4.1供试菌株 鉴于菌株盆栽回接筛选实验的庞大工作量，同一地域、同一宿主植物的同种根瘤菌株之间固氮促生功能与生理代谢的相似性，不同地理生态环境、不同种类的根瘤菌株之间代谢功能特性的差异性等特点[17]，本研究从已鉴定保存的根瘤菌株中优先选择分离自不同地域、不同种类的具有代表性的天蓝苜蓿根瘤菌作为盆栽筛选试验的供试菌株。

1.4.2盆栽播种 选取发芽率正常的百脉根种子，经75%酒精2 min、3%次氯酸钠10 min(玻璃棒搅拌2～3次)、无菌水清洗5～6次后，播种于盛有灭菌珍珠石的花钵中，置于人工气候室中培养(温度25℃、每天光照16 h)。1周左右种子发芽长出幼苗后浇Hoagland全营养液(上海国药)，幼苗生长3周后去除弱苗劣苗，每盆保留生长健壮的10株幼苗用于菌液回接处理。

1.4.3菌液培养 从-70℃超低温冰箱中取出用于筛选试验的保种根瘤菌株，融化后无菌接种环蘸取菌液于YMA平板上划线接种，28℃恒温倒置活化培养，待长出菌落后挑取单菌落接种于500 mL YMA液体培养基中，28℃，200 r·min-1恒温振荡培养5～7 d。

1.4.4盆栽回接筛选 每个菌株菌液回接百脉根花盆为1个处理，浇灌无菌YMA液体培养基为空白对照(CK)，每个处理设置3个重复，菌液或培养基的回接量为50 mL·盆-1。回接后每隔1天浇灌10 mL Hoagland营养液保持基质湿润。培养70 d，100 d后，以花盆基质表面的圆心为圆点，随机画出3条互为120度角的半径线，以每条半径线的中点处为取样位点，在每一处理的每个重复中选取3个百脉根植株，再另选1个长势适中的植株，共10个植株，取出冲洗干净并吸干根表水分，统计总根瘤数及单株根瘤数的平均值；将10个植株的地上部分和地下根系分离，105℃烘箱中杀青30 min，降至85℃恒温烘干12 h至恒重后，采用万分之一电子天平称重，计算单株地上生物量和地下生物量的平均值。

1.5 菌株的固氮酶活性测定

将全部待测菌株分别划线接种于CCM培养平板上，28℃下恒温倒置培养5～7 d，挑取单菌落接种至CCM液体培养基中，28℃，200 r·min-1恒温振荡培养5～7 d后，采用青岛科创质量检测有限公司的固氮酶(NITS)酶联免疫分析试剂盒测定各菌株的固氮酶活性。以OD值为横坐标，标准物的浓度为纵坐标，绘出标准曲线，通过标准曲线计算样品中固氮酶(NITS)的活性浓度，其中回归方程为Y=95.842 0x-3.958 5，R2=0.997 2。根据各菌株回接百脉根后的共生结瘤数、对植株地上地下部的促进生长量以及固氮酶活性的测定结果，筛选出优良固氮促生根瘤菌株。

1.6 数据统计分析

采用Excel 2010整理数据，选用LSD法对获得的数据进行多重比较，同时使用SPSS 18.0软件进行统计学分析。

2 结果与分析2.1 分离获得的根瘤菌菌株及其形态特征

从34份野生天蓝苜蓿根瘤样品中，经分离纯化和革兰氏染色鉴定，共获得83个革兰氏阴性(G-)纯化菌株。对全部G-菌株进行菌体形态的观察，显示菌体形态均呈杆状，长短不一，菌体表面有荚膜或无荚膜，但均有鞭毛，鞭毛周生、侧生或端生，符合根瘤菌的基本形态特征。

2.2 根瘤菌株的种类鉴定与区系分析结果

利用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取83个G-保存菌株的总DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，均形成23 kb左右的条带。选用16S rDNA序列PCR通用引物对P1—P6，所有待测菌株均扩增出约1.5 kb的序列片段。根据16S rDNA序列测定比对结果，结合菌体的形态学特征，分离获得的天蓝苜蓿根瘤菌株的种属鉴定结果见表1。鉴定结果显示，83个G-菌株中共鉴定出根瘤菌69株，其余14个菌株属于在根瘤内与根瘤菌一起共生的根瘤内生细菌。

表1 基于16S rDNA序列比对的天蓝苜蓿根瘤菌株分子鉴定结果Table 1 Taxonomic identification results of rhizobial strains of Medicago lupulina based on 16S rDNA sequence alignment

续表1

将鉴定出的根瘤菌种类进行区系分析(表2)，结果显示，分离获得的野生天蓝苜蓿根瘤菌分属于6个属25个种。6个属分别为：根瘤菌属(Rhizobium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)和假单胞菌属(Pseudomonas)。其中中华根瘤菌属的分布频率最高，达55.71%，为优势属；根瘤菌属和假单胞菌属次之，同为17.14%；25个种中的草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)分布频率最高，达到38.51%，为优势种。

表2 天蓝苜蓿根瘤菌株区系分析结果Table 2 The result of floristic analysis of rhizobial strains of Medicago lupulina

本研究供试的34份野生天蓝苜蓿根瘤样品采自于贵州5个生态功能区中的4个区域，4个生态功能区天蓝苜蓿根瘤菌的分类及种属分布结果如表3。分析结果表明，东部湿润亚热带常绿阔叶林生态区中鉴定出的种类最多，包括6个属中的24个种；其次是中部湿润亚热带喀斯特脆弱生态区，共鉴定出Rhizobium，Sinorhizobium和Pseudomonas3个属中的7个种；而西部半湿润亚热带针阔混交林、草山喀斯特脆弱环境生态区只鉴定出Sinorhizobium和Rhizobium2个属中的3个种，南部干热河谷南亚热带季雨林生态区仅鉴定出Sinorhizobium和Agrobacterium2个属中的2个种。

表3 研究区野生天蓝苜蓿根瘤菌种属分布特征Table 3 Species distribution characteristics of wild Medicago lupulina rhizobia in the study areas

2.3 共生结瘤固氮高效根瘤菌株的筛选

根据天蓝苜蓿根瘤菌的分离鉴定结果，按照不同地域和不同种类的挑选原则，共选出28个菌株作为筛选对象，分别为：ZLMR157-3，SSMR173-1，YEMR179-4，YLMR181-5，YHMR184-8，YMMR186-4，JMMR204-2，JMMR207-2，JMMR214-8，QCMR243-3，QCMR243-6，TFMR310-2，MXM R315-1，MLMR319-2，ZJMR341-3，ZWMR343-1，ZYMR346-1，ZYMR348-2，ZDMR352-1，WXMR364-1，WNMR367-1，WNMR367-2，WNMR367-3，WXMR380-2，WZMR395-2，WZMR395-3，DHMR424-1，DPMR429-1。

28个供试菌株菌液回接处理后，百脉根植株的根瘤平均数、地上部干重、地下部干重的测定结果见表4。与直接用无菌培养基浇灌的对照组(CK)相比，28个菌株都具有不同程度的共生结瘤和促生作用，单株平均结瘤数在9～53之间。对比根瘤数、地上部干重和地下部干重3项测定指标，发现其中9个菌株(ZLMR157-3，SSMR173-1，YLMR181-5，JMMR204-2，JMMR207-2，TFMR310-2，ZDMR352-1，WXMR380-2和WZMR395-2)的结瘤促生效果与对照和其余19个供试菌株呈显著(P<0.05)或极显著水平(P<0.01)的差异；9个优良菌株中又有5个菌株(SSMR173-1，YLMR181-5，JMMR204-2，TFMR310-2和WZMR395-2)的结瘤数和促生效应与其余4个菌株差异显著(P<0.05)，与对照和另外19个供试菌株的差异达极显著水平(P<0.01)。

表4 百脉根盆栽回接筛选试验测定结果Table 4 The determination results of the potted back inoculation and screening test of Lotus corniculatus

2.4 供试菌株固氮酶的活性

28个供试菌株固氮酶活性的测定结果见表5，供试根瘤菌株均具有固氮酶活力(27.85～265.61 IU·L-1)。不同菌株之间的固氮酶活性存在差异，其中促生效果较好的9个菌株的固氮酶活性也相对较高(208.73～266.33 IU·L-1)，活力大小顺序为：TFMR310-2>YLMR181-5>SSMR173-1>WZMR395-2>WXMR380-2>ZLMR157-3>JMMR207-2>ZDMR352-1，与其余19个菌株均呈显著(P<0.05)或极显著水平(P<0.01)的差异。

表5 供试根瘤菌株固氮酶活性测定结果Table 5 Measured result of nitrogenase activity of the experimental rhizobium strains 单位:IU·L-1

综合促生效果与结瘤固氮能力，在28个供试菌株中，分别分离自思南沙沟、印江朗溪、江口闵孝、天柱凤溪和威宁中水天蓝苜蓿根瘤样品的5个菌株SSMR173-1，YLMR181-5，JMMR204-2，TFMR310-2和WZMR395-2具有最高的固氮酶活性以及最强的结瘤促生能力，属于供试菌株中的最优固氮根瘤菌株；另外，分别分离自贞丰连环、江口民和、镇远大地和威宁秀水的4个菌株ZLMR157-3，JMMR207-2，ZDMR352-1和WXMR380-2，与除5个最优根瘤菌株以外的其余19个菌株的促生效果和结瘤固氮能力均呈现显著或极显著的差异，属于筛选出的优良根瘤菌株。

3 讨论

天蓝苜蓿作为一种适应性极强的野生豆科草本植物，在我国除青藏高原的高寒地区和荒漠以外，其余各地均有分布[18-19]，暗示其蕴藏着丰富的共生微生物资源。2008年，冯春生[7]采用数值分类法及分子生物学技术，对分离自我国西北地区的67株天蓝苜蓿根瘤菌进行了系统发育分析，表型分群方法和遗传分群方法一致表明，各代表菌株形成了根瘤菌属(Rhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)和中华根瘤菌属(Sinorhizobium)3个系统发育分支，而大部分菌株属于草木樨中华根瘤菌(S.meliloti)；同年，位秀丽[10]对西北尾矿区天蓝苜蓿根瘤菌的多样性进行了研究，通过多相分类方法和系统发育分析发现，69株供试天蓝苜蓿根瘤菌同样被分别划分在中华根瘤菌属、根瘤菌属和土壤杆菌属，其中64株属于中华根瘤菌属。两个研究结果显示，与天蓝苜蓿共生的根瘤菌种类较为专一。2009年张斌等[9]采用boxA1R单引物对分离自云南省楚雄州、德宏州、玉溪市、文山州及红河州部分地区天蓝苜蓿及南苜蓿根瘤的90株根瘤菌进行BOX-PCR分析和聚类分析，发现天蓝苜蓿根瘤菌可细分为7个遗传群，显示与天蓝苜蓿共生的根瘤菌又具有丰富的遗传多样性。

本研究从贵州岩溶山区分离到的天蓝苜蓿根瘤菌中，也包含有中华根瘤菌属、根瘤菌属和土壤杆菌属的种类，其中中华根瘤菌属在全部6个属中所占比例最大，草木樨中华根瘤菌在所有25个种中的比例也最高，它们是天蓝苜蓿根瘤菌中的优势属和优势种；对分离自贵州4个生态功能区中的天蓝苜蓿根瘤菌分别进行区系分析发现，不同生态功能区所鉴定出的属种数量各不相同，但是每一个功能区中都包含有中华根瘤菌属和草木樨中华根瘤菌的种类。说明中华根瘤菌属以及其中的草木樨中华根瘤菌是与天蓝苜蓿较为专一的共生根瘤菌种类，这一结果与冯春生[7]、位秀丽[10]的研究结论是一致的。而另一方面，除中华根瘤菌属、根瘤菌属和土壤杆菌属的种类以外，本研究在贵州天蓝苜蓿根瘤菌中同时还鉴定出假单胞菌属(Pseudomonas)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的种类存在，这一结果又与张斌等的研究结论有相似之处。这进一步说明，每一种豆科植物，除了存在与其较为专一的共生根瘤菌种类以外，生态地理环境对共生根瘤菌的多样性也存在着深刻的影响[20]。贵州省生态环境复杂多样，不同生态功能区域中不同的地理生态条件导致不同种类的根瘤菌会与天蓝苜蓿共生结瘤，从而形成了贵州岩溶山区天蓝苜蓿根瘤菌特定的丰富多样性，这也更加证实了陈文新等关于根瘤菌与豆科植物的共生关系会因区域地理环境的差异而呈现出不同多样性的科学观点。

从科学理论的角度讲，每一种植物分离出的根瘤菌，首先应该回接该种植物，但由于本研究的筛选试验是与分离自贵州多花木蓝和葛藤的根瘤菌同时进行的，目的是为了筛选获得寄主识别范围广、结瘤固氮能力强的抗逆高效根瘤菌株，因此一并选择了既是一种优良豆科牧草和饲用植物[21]又是一种水土保持性能良好的抗逆先锋植物的百脉根[22]作为回接宿主植物。这是鉴于生产应用目的的考虑，但是将根瘤菌株回接其分离宿主植物的科学价值还是不可忽略的，本研究将在下一步继续开展利用筛选出的优良固氮菌株回接天蓝苜蓿的后续试验，以对优良菌株的结瘤促生特性作出进一步的鉴定。

本研究根据共生结瘤数、对共生宿主植物的促生效果以及菌株本身的固氮酶活性三项参数，筛选获得了9株促生固氮效果良好的根瘤菌，其中有5株被鉴定为优良菌株中的最优固氮根瘤菌，它们的固氮酶活性以及对宿主植物的促生长率都与另外4个优良菌株呈现出显著水平的差异。本文对固氮酶活性的测定是在独立培养菌株的条件下进行的，有研究者认为，根瘤菌是在与豆科植物共生的情况下行使生物固氮功能的，单独测定根瘤菌株的固氮酶活力未必能够代表共生根瘤菌的固氮能力。但是，Pagan[23]研究报道中提出，根瘤菌独立生长时在一定的环境条件下其固氮酶活性也能表达，这一发现突破了根瘤菌只有与高等植物共生才能固氮的概念。与共生条件下相比，采用生物试剂盒对独立菌株固氮酶活力的测定值可能偏低，但它在一定程度上依然能够反映出根瘤菌的共生固氮能力[24]。本研究筛选出的9个优良菌株的结瘤促生效果及固氮酶活性均与其余19个供试菌株的差异达显著或极显著水平，表明筛选的结果能作为贵州岩溶山区草地生态畜牧和喀斯特环境修复的共生微生物资源。

4 结论

贵州天蓝苜蓿根瘤菌主要包括中华根瘤菌属、根瘤菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、中慢生根瘤菌属和慢生根瘤菌属6个属的25个种，其中中华根瘤菌属是优势属，草木樨中华根瘤菌是优势种，采样涉及的4个生态功能区域中天蓝苜蓿根瘤菌的种属数量和区系分布特征存在着明显的差异性。

从分离鉴定的天蓝苜蓿根瘤菌中，优先选择28个来自不同地域和不同种类的菌株作为筛选对象，其中9个菌株(ZLMR157-3，SSMR173-1，YLMR181-5，JMMR204-2，JMMR207-2，TFMR310-2，ZDMR352-1，WXMR380-2和WZMR395-2)对多年生优良豆科饲用牧草百脉根具有良好的共生结瘤和固氮促生效果，具有开发应用潜力。