葡萄枝叶自然青贮中优选乳酸菌的分离与鉴定

杨泽毅，张玉琳，杨寒珺，车 冰，张凡凡*，马春晖*

(1. 石河子大学动物科技学院， 石河子 新疆 832000； 2. 新疆青牧力生物科技有限公司， 石河子 新疆 832000)

葡萄(Vitisvinifera)是我国六大水果之一，其产量、栽培面积占全国果树总量的第4位，在我国水果生产中占据重要地位；其中新疆作为我国葡萄主要产区，鲜食及酿酒葡萄栽培面积达220万亩以上，占全疆水果生产的1/3以上，产业化基础相对雄厚[1]；而作为新疆地区农牧民赖以生存的畜牧业，正面临“种草无人、草品低下”的产业困境；此外，在国家及地方“畜牧业高质量发展”政策实施的背景下，反刍动物养殖逐步由散养、放牧方式向舍饲、半舍饲方式转变，导致地区饲料短缺问题越发严重。因此，合理利用葡萄副产品资源，可有效缓解种草养畜压力，丰富家畜粗饲料来源，为地区畜牧业可持续发展提供基础。

葡萄副产品资源主要包括葡萄皮渣、葡萄枝叶等。目前大量研究证实，葡萄皮渣中含有丰富营养、抗氧化物质等，作为牛羊发酵饲料不仅可有效提高乳、肉品质，而且能显著提高家畜免疫性、抗氧化性等[2-4]，因而已被广泛应用。葡萄枝叶主要为葡萄冬剪后的全部枝叶(800 kg·m-2)，其中含有丰富的糖源、多酚、蛋白等营养物质[5-8]，而本地区尚无合理利用方式，主要采用粉碎还田或焚烧的方式处理，导致大量资源的浪费且造成环境污染。如将葡萄枝叶调制成青贮饲料，不仅可最大化保存其营养物质，改善家畜适口性，且可提高粗饲料资源的利用效率[9]。

乳酸菌是主导青贮发酵的关键，其可改善青贮原料中的微生物区系、优化发酵进程，进而确保青贮养分的保存，而其中乳酸菌类型、多样性、活性以及数量均会影响青贮的发酵品质[10-11]。青贮过程中乳酸菌根据其发酵葡萄糖的形式分为同质型乳酸菌和异质型乳酸菌，同质性乳酸菌通过糖酵解(EMP)途径产生乳酸，其在发酵过程中能够快速积累大量乳酸，降低发酵体系pH值，抑制其他有害微生物生长，且能够减缓蛋白类物质的腐败[12-13]；异质性乳酸菌通过磷酸解酮酶(PP)途径产生乙酸、乳酸等，其虽比同质型乳酸菌产酸能力差，但在发酵过程中产生的乙酸等挥发性脂肪酸能有效减缓青贮二次发酵，提高青贮的有氧稳定性[13-14]。对于葡萄枝叶自然青贮过程，虽底物营养物质丰富[15]，但发酵过程中优良乳酸菌的种类及其对不同糖源酵解的方式是青贮能否进一步改善的关键。目前已有诸多关于牧草中天然附着乳酸菌分离及其在青贮中的应用的研究，其已筛选出多种具有较强的耐低温、耐盐、产酸能力的乳酸菌菌株[16-17]，而对于葡萄枝叶自然青贮中优势乳酸菌的研究较少。鉴于此，本研究通过对葡萄枝叶自然青贮过程中的优势乳酸菌进行分离、筛选和生物学特性研究，为葡萄枝叶资源的青贮饲料化利用提供基础。

1 材料与方法1.1 青贮饲料样品

选择种植于新疆石河子市第八师152团葡萄种植1号地(86°1′26″ N，44°13′58″ E)酿酒用葡萄白玉霓和烟73的枝叶做为青贮原料，将其粉碎至1～1.5 cm，称取2 kg装入16 cm×25 cm真空袋中，共调制20袋。经真空封口机密封后，置于18～23℃条件下，自然发酵60 d。

1.2 主要培养基及试剂

试验所用MRS培养基、MRS肉汤培养基购置于广东环凯微生物科技有限公司，M17肉汤培养基、M17培养基、革兰氏染色液试剂盒、糖微量发酵管购置于北京缘生化科技有限公司，细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

1.3 乳酸菌的分离与纯化

分别在发酵第3，7，15，60 d，称取10 g葡萄枝叶青贮样品放入90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，密封，置于摇床上以120 r·min-1摇动2 h(37℃)，在无菌操作台中，吸取1 mL上清液加入到9 mL无菌生理盐水中，漩涡振荡，以此稀释成4个梯度(10-8～10-5)，分别取4个梯度的菌液100 μL涂布于固体MRS平板培养基和M17平板培养基上，30℃培养48～72 h，观察菌落的形态、大小、颜色和光泽，选择典型的钙溶性环菌落进行革兰氏染色、油镜和过氧化氢酶接触试验。经过革兰氏染色(呈阳性)和过氧化氢酶(呈阴性)试验，初步判断乳酸菌种类。接着在MRS固体培养基和M17固体培养基上划线，恒温培养30℃，48～72 h，重复划线分离培养3次，得到纯化的单菌株。用MRS液体培养基和M17液体培养基进行富集培养(30℃，24 h)，与甘油1∶1等体积混合，封装，-80℃保存备用。

1.4 乳酸菌的鉴定

1.4.1测定生长曲线 将分离纯化的乳酸菌菌液混匀并提取其悬液以6%的浓度接种至MRS培养基中，恒温培养(37℃)24 h，期间每2 h用紫外可见分光光度计(日立，U-2910)测其在波长600 nm的OD值，每个菌种均重复3次，最终将测定结果绘制生长曲线。

1.4.2产酸速率测定 将乳酸菌菌液混匀，提取其悬液以3.0 %的浓度接种于pH 6.5的MRS液体培养基中，恒温(37℃)培养24 h，期间每2 h用pH计(上海雷磁仪器有限公司)测发酵液的pH值，每个菌种均重复3次，最终将测定结果绘制产酸速率曲线。

1.4.3生理生化鉴定 将保存备用的乳酸菌菌株活化24 h后，参照凌代文[18]和刘慧[19]的方法进行乳酸菌生理生化特性鉴定。将各乳酸菌菌株以3%的浓度接种于MRS液体培养基、M17液体培养基中，分别在4，10，30，45℃条件下进行培养，其中4℃培养10 d，10℃与30℃培养3 d，45℃培养7 d，培养结束后观察乳酸菌菌株对温度的响应情况。分别在pH值3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0以及浓度为3.0%和6.5% NaCl的MRS液体培养基、M17液体培养基中30℃培养48 h，观察乳酸菌菌株对酸碱与盐的耐受能力。主要采用用紫外可见分光光度计测定乳酸菌在波长600 nm的OD值，以判断乳酸菌在不同环境下的生长情况(弱生长,0.2<OD值<0.5;生长,0.5<OD值<0.1;不生长,OD值1.0)。用细菌微量生化鉴定管(由广东环凯微生物科技有限公司提供)检测乳酸菌菌株对18种碳源的利用情况。均重复测定3次。

1.4.4乳酸菌的16S rDNA序列测定 按照试剂盒法，提取纯化乳酸菌菌株的DNA，DNA提取试剂盒由北京全世金生物技术有限公司提供。PCR扩增引物采用细菌通用引物：FA-27F：5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGA

TCCTGGCTCAG-3′和RA-1495R：5′-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGGTACCTTGTT-ACGA-3′。PCR反应体系为(50 μL)：DNA模板5 μL，引物27F和1495R(10 μmol·L-1)各1 μL，2×Master Mix 25 μL，dd H2O补足至50 μL。反应程序为：95℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，共30个循环。PCR结束后进行琼脂糖电泳检测及纯化，将纯化后产物送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。

1.5 数据统计分析

采用Excel 2018对所得试验数据进行整理，采用Origin 2017软件进行相关绘图，经过测序后的乳酸菌16S rDNA序列在GenBank中进行比对，采用MEGA 7.0软件中的Clustal W对最近类群的序列进行多重比较分析，并使用软件中的邻位归并法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，确定各菌株分类地位[20]。

2 结果与分析2.1 乳酸菌菌株的生理生化特性分析

葡萄枝叶自然青贮中分离并提纯所得到的乳酸菌菌株，经过镜检及生理生化特性鉴定表明，所有菌株革兰氏染色均为阳性，触酶实验呈阴性。各菌株镜检均呈单、对或成链排列的卵圆形或球形，无运动性、无芽孢，初步鉴定结果符合乳球菌(Lactococcusspp.)的生物学特性(图1)。其中，Q1菌株在发酵葡萄糖过程中产气，初步鉴定为异质型乳酸菌；其他菌株发酵葡萄糖不产气，初步鉴定为同质型乳酸菌(表1)。

图1 葡萄枝叶自然青贮中乳酸菌革兰氏染色结果Fig.1 Gram staining results of lactic acid bacteria in natural silage of grape branches and leaves

通过各菌株在不同温度的生长情况表明(表1)，4℃,10℃,30℃和45℃时，各菌株均表现出生长或微弱生长。各菌株均能在3%和6.5% NaCl条件下表现出良好的生长特性。在不同pH值条件下，各菌株均能在pH 3.5～9的范围内生长或微弱生长，其中仅Q1菌株在pH为9时不能生长。

表1 葡萄枝叶自然青贮中乳酸菌的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria in natural silage of grape branch and leaf

续表1

对初步筛选出的5株乳酸菌进行18种碳源发酵实验，结果表明(表2)，Q1除松三糖、纤维二糖无法利用外，其余糖、醇均可利用。Q2和Q5不能利用松三糖、鼠李糖、乳糖，棉子糖为可变反应。Q3不能利用松三糖、鼠李糖、山梨醇、乳糖，棉子糖为可变反应。Q4不能利用棉子糖、木糖、甘露醇、山梨醇、菊糖、鼠李糖，松三糖为可变反应。

2.2 乳酸菌菌株16S rDNA基因序列分析

经过BLAST比对，所筛选出的5株乳酸菌菌株与标准菌株相似性均达到97.5%以上。将各菌株与参考乳酸菌菌株共同构建系统进化树，结果表明(图2)，Q1与肠膜明串珠菌CJNU 0705(L.Mesenterica)，Q2与屎肠球菌R 12(E.faecium)，Q3与铅黄色肠球菌AU11(E.casseliflavus)的亲缘度为100%；Q4与海氏球菌1-W1-4(E.Hirae)，Q5与屎肠球菌FS 86(E.faecium)的亲缘度为99%。根据16S rDNA基因序列的同源性分析的结果，Q1菌株确定为肠膜明串珠菌(L.Mesenterica)，Q2和Q5菌株为屎肠球菌(E.faecium)，Q3菌株为铅黄色肠球菌(E.casseliflavus)，Q4菌株为海氏肠球菌(E.Hirae)。Q1，Q2，Q3，Q4，Q5在Genbank中的登录号及用于构建系统发育树的乳酸菌菌株见表3。

表2 葡萄枝叶自然青贮中乳酸菌碳源发酵试验Table 2 Fermentation test of lactic acid bacteria carbon sources in natural silage of grape branch and leaf

图2 葡萄枝叶自然青贮中乳酸菌基于16S rDNA的系统发育树Fig.2 16S rDNA-based phylogenetic tree of lactic acid bacteria in natural silage of grape branch and leaf

表3 葡萄枝叶自然青贮中乳酸菌菌株的16S rDNA基因序列分析结果Table 3 Analysis results of 16S rDNA gene sequence analysis of lactic acid bacteria strains in natural silage of grape branches and leaves

2.3 乳酸菌菌株的产酸速率及生长特性

通过对各乳酸菌菌株的产酸速率与生长速率分析，结果表明(图3-A、图3-B)，各菌种在培养4～6 h后进入对数生长期，所有菌株在12 h后进入稳定期，且24 h内未见迟滞期，生长速率与产酸速率均成正比。菌株Q1、Q3在0～10 h产酸及生长速率基本相同；10 h后，Q1的产酸速率与生长速率继续增加，而Q3的产酸速率明显下降，最后均趋于平缓。0～6 h时Q2、Q4、Q5产酸及生长速率基本相同，而6 h后Q4生长速率高于其他菌株，12 h后各菌株生长速率均趋于平缓，24 h时，Q4菌株的数量最多(OD=1.42)。24 h内，除Q3外的其余菌株pH值均在降到4.50以下；其中，Q4均产酸能力最强，24 h时的pH值下降至4.11。

图3 葡萄枝叶自然青贮中乳酸菌菌株的产酸速率及生长速率Fig.3 Acid production rate and growth rate of lactic acid bacteria strains in natural silage of grape branch and leaf

3 讨论3.1 葡萄枝叶自然青贮过程中乳酸菌的分离与鉴定

秸秆类植物在青贮过程中，其表面自然附着乳酸菌适应能力更强，因此在青贮过程中起到不可替代的作用[21]。将植物表面附着优良乳酸菌进行分离，并用于青贮发酵则是一种高效而又快速的方法[21-22]，目前国内外诸多青贮发酵剂，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、戊糖片球菌(Pedococcuspentosaceus)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)等，均筛选于自然发酵的青贮玉米。本研究采用微生物分子生物学鉴定法(16S rDNA序列分析法)，相比于传统的微生物鉴定法更加准确，其主要通过不不同菌种间16S rDNA可变区序列存在差异，而恒定区的序列基本保守这一特性设计引物，扩增16S rDNA片段后，利用可变区序列的差异性，对不同菌种的细菌进行分类鉴定，对于界限较模糊的菌株，均能很好的进行鉴定，更为客观、方便、高效的解决菌种之间的分类问题[23]。如：肠膜明串珠菌(LeuconostocMesenterica)、类肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和假肠膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesentery)均属于明串珠菌属(Leuconostocspp.)，三者拥有相似的可发酵糖源，而采用本研究序列分析法能够准确的判断出Q1为L.Mesenterica。此外，本研究中，通过5株乳酸菌菌株对18碳源发酵试验得出，Q1,Q2,Q4与Q5对于碳源的利用模式与模式菌株标准一致[18]。Q3不能利用松三糖、鼠李糖、山梨醇、乳糖，而模式株铅黄色肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)可发酵乳糖，这与标准不同，存在一定差异。由此进一步证实，单独采用生理生化标准鉴定乳酸菌种属并不准确，需结合分子生物学方法综合鉴定。通过对本研究中的乳酸菌的16S rDNA序列在GenBank中进行比对，Q1与L.Mesenterica序列相似性达到了99.36%，Q2和Q5与屎肠球菌(E.faecium)序列相似性分别为99.64%、98.31%，Q3与铅黄色肠球菌(E.casseliflavus)序列相似性为97.96%，Q4与海氏肠球菌(E.Hirae)序列相似性为97.69%。本研究所筛选出的5株菌与标准菌株的进化亲缘度均达到了99%以上。因此可确定Q1为L.Mesenterica，Q2、Q5为E.faecium，Q3为E.casseliflavus，Q4为海氏肠球菌E.Hirae。

3.2 葡萄枝叶自然青贮过程中分离乳酸菌的特征分析

产酸能力和生产速率都是衡量相同条件下乳酸菌利用资源发酵能力的重要参数，也是筛选适合发酵原料的优良乳酸菌菌株的重要指标[24]。本研究中所有乳酸菌菌株在发酵过程中迟滞期不明显，说明在培养基溶液中生长繁殖速度快，乳酸菌数量增值迅速，起到了促进发酵和快速降低pH值的作用[25]。以往研究表明，用于青贮发酵菌剂的微生物都具有统一的发酵途径，可利用的可溶性碳水化合物较为广泛，且可产生大量乳酸，适应较大的温度范围，耐酸能力强，能快速降低pH值(4.2以下)至优质青贮标准，从而抑制其他有害微生物生长[26-27]。理论上看，本研究筛选的Q1、Q2、Q4、Q5均适合青贮饲料的发酵，而进一步通过乳酸菌菌株在pH 3～9，4℃～45℃，3%和6.5% NaCl浓度不同环境下进行生长，其目的就是初步筛选出拥有较强耐酸、耐盐能力及拥有较广生长温度范围的菌株，其中，E.Hirae在24 h内均表现出最快的生长速率(图3A)，这与以往在发酵酸奶中研究结果相同，其研究不仅证实了E.Hirae具有较快的生长速率；与食品用菌株嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)不产生拮抗作用，且还具一定益生作用[28]。E.Hirae在12 h内产酸能力相对较弱，12～24 h才表现出较强的产酸能力(图3B)，且对于酸性环境的耐受能力更强，即在pH=4的环境下依然能够生长(表1)，其原因主要为E.Hirae对于发酵底物碳源的利用种类较少(表2)，本研究为理论条件(培养基环境)，缺乏合适的发酵底物和发酵环境；因此其在发酵饲料中的实际利用及多种益生性还有待继续挖掘。

大量研究证实，乳酸菌作为青贮主要发酵菌种之一，除了能改善青贮品质，还具有多种益生功能和抑菌作用[29-31]。本研究筛选的菌株均在我国农业农村部饲料添加剂目录(2045号公告)中，且在饲料工业方面大量应用。其中，E.faecium添加至肉鸡日粮中可有效改善肠道菌群并提高其生长性能，增强免疫功能，抑制细胞氧化衰老，降低氨气的排放量[32-33]。L.Mesenterica作为乳酸菌中的重要菌种，具有相当高的生物安全性，且分泌出的细菌素能抑制多种病原细菌的生长[34-35]；此外抑菌物质能够被乙酸乙酯萃取出，具有一定的热稳定性[32-33]。E.Hirae具有降低胆固醇的潜力，对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、E.coli等肠道病原体有显著的抑菌作用[36]，且可改善人体血脂，调节肝脏糖脂代谢[37]。此外，这些菌株在食品发酵工业和医药等方面也具有诸多潜在价值，而本研究仅进行了乳酸菌的筛选鉴定，以及初步分析了5种乳酸菌的生理生化、碳源利用、生长和产酸特征，更多的功能性研究还有待挖掘。

4 结论

本研究从葡萄枝叶青贮中分离得到了5株乳酸菌菌株，均具有较强的耐盐、耐酸能力，以及广泛的温度适应范围和碳源利用情况，其中Q1鉴定为肠系膜明串珠菌(L.Mesenterica)，Q2和Q5鉴定为屎肠球菌(E.faecium)，Q3鉴定为铅黄色肠球菌(E.casseliflavus)，Q4鉴定为海氏肠球菌(E.Hirae)。其中，Q4菌株在培养至24 h后其菌液pH为4.13，OD值为1.40，表现出最强的产酸能力和生长速率。