房山紫堇叶绿体基因组特征及其系统进化关系

孙 哲， 李澳旋， 杜晓蓉， 宋 芸， 乔永刚*

(1. 山西农业大学生命科学学院， 山西 太谷 030801； 2. 中兽医药现代化山西省重点实验室， 山西 太谷 030801)

紫堇属是罂粟科最大的一个属，在全球约有440种，为草本植物，无乳汁[1]。房山紫堇(CorydalisfangshanensisW. T. Wang ex S. Y. He)又称石黄连、土黄连，是罂粟科紫堇属的一种多生长于海拔500～1 600 m左右石灰岩山坡的植物[2]，开白色小花，生命力顽强，可防风固沙、保持水土[3]；其根可入药，具有清热解毒的功效[4]。因独特的形态，特殊的生长环境和稀少的数量，房山紫堇被列为北京市重点保护野生植物。开展房山紫堇的保护和科学研究，可以使其在园林绿化、水土保持等方面发挥重要作用，也有利于丰富草地生态系统。

叶绿体是植物光合作用的场所[5]，随着一些生物技术的开发和应用，叶绿体的基因组大小得到确定，被子植物的叶绿体基因组大小为120～170 kb不等，通常编码110～130个基因[6]。高等植物的叶绿体基因组结构高度保守，可以确保在进化群体之间基因的直接同源性，包括反向重复区(Inverted repeats,IRs)和大单拷贝区(Large single copy,LSC)、小单拷贝区(Small single copy,SSC)，植物叶绿体基因组的大小差异由IRa和IRb决定[7]。叶绿体基因组所包含的遗传信息没有核基因组多，但其结构稳定并且保守[8]，可以为高等植物群体遗传学、系统发育和基因组进化提供依据[9-10]。

紫堇属植物在形态上很难区分，被认为是罂粟科中最难分类的一个属[11]，叶绿体基因组可以为紫堇属植物的系统发育提供参考，国内外已经有紫堇(CorydalisedulisMaxim.)、陕西紫堇(CorydalisshensianaLiden)[12]、毛黄堇(CorydalistomentellaFranch.)、石生黄堇(CorydalissaxicolaBunting)[13]、斑花黄堇(CorydalisconspersaMaxim.)[14]等紫堇属植物叶绿体基因组的相关报道。本研究对房山紫堇叶绿体基因组进行测序，对其GC含量、SSR位点等进行分析，并与紫堇属其他物种的基因组进行多重比较，以期为房山紫堇的系统发育和紫堇属植物的亲缘关系提供数据支撑，同时丰富紫堇属植物的叶绿体基因组数据库。

1 材料与方法1.1 试验材料

房山紫堇种子采集自山西省陵川县丈河村(北纬35°33′～35°38′，东经113°08′～113°17′)，在实验室育苗后，移栽到药用植物资源圃。于2020年10月采集健康无病害的房山紫堇植株的新鲜叶片，用酒精棉擦拭后，快速放入液氮，保存于—80℃冰箱备用。

1.2 试验方法

1.2.1DNA提取和测序 用CTAB法提取保存的房山紫堇叶片DNA[15]，DNA质量和浓度检测合格后，将DNA片段化(超声波打断)，经过片段纯化、末端修复等途径获得测序文库，质检合格后在陕西博瑞德生物科技有限公司用Illumina HiSeq进行测序。

1.2.2基因的组装和注释 用NOVOPlasty软件[16]对测序所得的房山紫堇叶绿体基因组进行组装，参考序列为Coreanomeconhylomeconoides(NC_031446.1)[17]，获得的叶绿体基因组用CPGAVAS软件[18]进行基因注释，结果提交至GenBank，序列号为MZ772033，用OGDRAW在线软件[19]将结果可视化，GC含量用MEGA7[20]软件进行分析。

1.2.3简单重复序列(Simple sequence repeats，SSR)位点分析 利用MISA软件[21]对房山紫堇的SSR位点进行分析，设置重复次数：单核苷酸>10，双核苷酸>6，三核苷酸>5，四核苷酸>5，五核苷酸>5，六核苷酸>5；2个SSR之间的最小距离为100 bp。

1.2.4密码子组成及偏好性 运用软件CodonW1.4.2[22]分析其叶绿体基因组的有效密码子数(Effective number of codon,Nc)、相对同义密码子使用情况(Relative synonymous codon usage,RSCU)、密码子适应指数(Codon adaption index,CAI)、密码子偏好性指数(Codon bias index,CBI)、最优密码子使用频率(Frequency of optimal codons,FOP)等密码子组成参数，RSCU>1的密码子具有偏好性[22]。

1.2.5多重比较和IR收缩与扩张分析 利用mVISTA软件[23]将房山紫堇与石生黄堇、紫堇、毛黄堇叶绿体基因组进行多重比较，使用IRscope软件[24]分析房山紫堇与石生黄堇、紫堇、毛黄堇的IR收缩与扩张情况。

1.2.6系统发育分析 以房山紫堇基因组序列和已经公布的9个紫堇属植物基因组序列为研究对象，选取苦参(SophoraflavescensAlt.)和苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)为外群[25]，利用MAFFT软件[26]对12个物种的叶绿体全基因组进行比对，并使用MEGA7软件构建ML系统发育树，自展值Bootstrap value设为1 000，使用Kimura 2-parameter模型。

2 结果与分析2.1 叶绿体基因组特征

基于边合成边测序技术，使用Illumina HiSeq高通量测序平台对房山紫堇叶绿体基因组进行测序，共得到10.45 GB原始数据，各样品Q30碱基百分比均不小于90%。房山紫堇的叶绿体基因组为191 128 bp，GC含量为40.2%;呈现典型的四分体结构(图1)，大单拷贝区(LSC)为97 302 bp、小单拷贝区(SSC)为9 836 bp，反向重复区(IRa，IRb)为83 990 bp，GC含量分别为39.1%，35.2%，42.1%。

图1 房山紫堇叶绿体基因组示意图Fig.1 Chloroplast genome map of Corydalis fangshanensis

房山紫堇叶绿体基因组共注释到127个基因(表1)，包括84个蛋白质编码基因、35个tRNA基因以及8个rRNA基因，占比分别为66.1%，27.6%，6.3%。根据不同的功能可将这些基因分为4类，包括atpA，atpB，atpE，atpF，atpH等44个与光合作用有关的基因；rpl14，rpl16等73个与自我复制相关的基因；还有infA等其他基因以及一些功能未知的基因。其中17个基因具有内含子，rps12，trnA-UGC，trnE-UUC，ndhB基因的内含子多于1。

表1 房山紫堇叶绿体基因功能分类Table 1 Chloroplast gene functional classification of Corydalis fangshanensis

2.2 SSR位点分析

对房山紫堇单基因序列进行分析，结果显示(表2)，共检测到40个SSR位点，其中单核苷酸有31个，双核苷酸有8个，三核苷酸有1个。单核苷酸最多，包括7个A(占比17.5%)，1个C(占比2.5%)，23个T(占比57.5%)；双核苷酸总共8个，包括4个AT(占比10%)和4个TA(占比10%)；三核苷酸只有1个CAA(占比2.5%)。

表2 房山紫堇SSR位点分析Table 2 SSR loci analysis of Corydalis fangshanensis

2.3 密码子偏好性分析

对房山紫堇叶绿体基因组的密码子组成分析结果显示(表3)：房山紫堇基因组的有效密码子数为56.57，说明其密码子偏好性较弱；GC含量为41.2%，GC3s含量为38.5%，均小于50%，说明密码子偏向使用碱基A和碱基T。

表3 房山紫堇叶绿体基因组密码子使用的总体特征Table 3 Overall characterization of codon usage in the chloroplast genome of Corydalis fangshanensis

对房山紫堇叶绿体基因组的相对同义密码子进行分析(图2)，RSCU>1的密码子有35个，其中以A/T碱基结尾的有28个，占80%，表明这些密码子偏向以A/T结尾。

图2 房山紫堇叶绿体基因组的相对同义密码子使用情况Fig.2 Relative synonymous codon usage in chloroplast genomes of Corydalis fangshanensis

2.4 比较基因组学和IR收缩与扩张分析

以测序所得的房山紫堇基因组序列为参照，将其与石生黄堇、紫堇、毛黄堇进行相似性比较分析，结果如图3所示，4种紫堇属植物的编码区较为保守，在ycf2，trnN-GUU，ndhF等基因所在的位置存在明显的变异。边界分析结果如图4所示，房山紫堇rpl2基因位于LSC区；ndhA基因位于IRb与SSC的交界处，在IRb区267 bp，SSC区域1 902 bp；ycf1位于SSC区域，距离SSC与IRa的交界407 bp；rpl23位于IR区域，距离IRa与LSC的交界35 bp，石生黄堇与房山紫堇的边界收缩情况最为相似。

图3 房山紫堇与石生黄堇、紫堇、毛黄堇的多重比较结果Fig.3 The results of multiple comparisons between Corydalis fangshanensis and Corydalis saxicola,Corydalis edulis and Corydalis tomentella

图4 房山紫堇与石生黄堇、紫堇、毛黄堇的边界比较Fig.4 Boundary comparison of Corydalis fangshanensis and Corydalis saxicola,Corydalis edulis and Corydalis tomentella

2.5 系统发育分析

为了鉴定房山紫堇在紫堇属植物中的进化位置，使用MEGA7构建ML系统进化树，结果显示(图5)，紫堇属植物可以分为两大类，房山紫堇与同属植物紫堇、毛黄堇、石生黄堇聚为一大类，与紫堇[10]的亲缘关系最近；灰绿黄堇(CorydalisaduncaMaxim.)[27]与其余5种紫堇属植物聚为另一大类；外源植物苦参与苦豆子聚为一类，与前人的研究一致[16]。

图5 基于叶绿体基因组的紫堇属植物系统发育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of Corydalis based on chloroplast genome

3 讨论

紫堇属植物物种丰富，种类繁多，仅根据形态很难对其分类。2015年山西首次报道发现了房山紫堇，房山紫堇全株可入药，抗逆性强，对环境要求较低，可在干旱缺水的石灰岩环境中生存，具有防风固沙、水土保持的生态价值[28]。房山紫堇被列入《世界自然保护联盟红色名录》(IUCN)中，中国珍稀濒危植物信息系统将其列为易危(VU)植物，禁止直接采挖[29]。

目前有部分紫堇属植物的叶绿体基因组数据得到公布[30]，大部分紫堇属植物的叶绿体基因组有待揭示。叶绿体基因、线粒体基因和细胞核基因是系统发育和物种起源研究中常用的三种数据来源[31]。高度保守的叶绿体基因组[8]含有丰富的遗传信息，研究房山紫堇的叶绿体基因组对了解房山紫堇的属内进化位置、遗传变异、系统发育以及开发利用等具有重要的价值。

SSR位点分析对研究物种鉴定、遗传变异、系统进化有重要意义，对房山紫堇进行SSR位点分析，发现其有40个SSR位点，包括单核苷酸、双核苷酸和三核苷酸，房山紫堇叶绿体基因组SSR多含有AT碱基，与前人研究结果一致[32]。Nc，RSCU，GC，GC3s均可以反映密码子的偏好性，Nc值通常在20～61之间，靠近61偏好性弱，靠近20偏好性强；RSCU>1时，该密码子为使用频率较高的密码子，RSCU=1时，密码子没有偏好性，RSCU1的密码子超过半数，其中以A/T碱基结尾的占80%，并且GC含量和GC3s含量均小于50%，房山紫堇偏向使用AT碱基，与段春燕[33]、宋芸[34]等人的研究结果一致。植物叶绿体基因组的收缩和扩张是其变异的主要机制，本研究对房山紫堇基因组与石生黄堇、紫堇、毛黄堇进行比较分析，结果显示石生黄堇与房山紫堇的边界收缩情况高度相似。聚类结果显示：紫堇属植物序列被聚为一类，两种豆科植物作为外源种被聚为一类[25]，与预期结果一致，房山紫堇与紫堇的亲缘关系最近，在对房山紫堇进行开发利用时，可将紫堇作为参考物种。本研究丰富了紫堇属植物的叶绿体基因组数据，为探索紫堇属植物的起源及亲缘关系提供了依据，为房山紫堇的进一步科学研究奠定了基础。

4 结论

本研究用Illumina HiSeq对房山紫堇进行测序，将测序结果进行整理得出以下结论：房山紫堇的叶绿体基因组大小为191 128 bp，GC含量为40.2%，呈现典型的四段式结构，注释到127个基因；有40个SSR位点；叶绿体基因组的密码子偏好性较弱，偏向使用A和T这两种碱基；编码区较为保守；房山紫堇与紫堇的亲缘关系最近。目前对房山紫堇的报道很少，本研究为房山紫堇的物种保护、系统进化、资源的开发利用提供了相关试验数据和理论依据。