化学添加剂对有氧胁迫下湿贮玉米发酵品质和有氧稳定性的影响

刘宇洋, 高文韩, 孔令芝, 郑杨晨, 刘 畅, 何 涛, 薛艳林, 李井春, 李雁冰*

(1. 黑龙江八一农垦大学动物科技学院， 黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室， 黑龙江 大庆 163319；2. 内蒙古自治区农牧科学院， 内蒙古 呼和浩特 010031； 3.农业农村部东北平原农业绿色低碳重点实验室， 黑龙江 大庆 163319)

湿贮玉米又称高水分玉米，是指将水分含量在28%～35%或以上破碎后进行贮藏和发酵的玉米籽粒[1]。与干玉米相比，由于湿贮过程中淀粉颗粒的疏水基被微生物分解，湿贮玉米具有在瘤胃中更容易被消化的优点，进而成为一种广泛使用的反刍动物饲料[2]。湿贮玉米可减少玉米收获时的烘干成本，在发生暴雨、洪涝等自然灾害后，直接将受灾玉米收获进行湿贮，也可减少损失[3-4]，因此，制作湿贮玉米这一方式值得使用与推广。

Canizares等[5]使用不同比例的湿贮玉米代替干玉米饲喂阿尔卑斯山羊，发现在日粮中使用湿贮玉米对产奶量没有任何影响，可以完全替代干玉米；Archibeque等[6]研究结果表明，使用湿贮玉米代替干玉米饲喂肉牛，可以明显减少牛粪中的淀粉和臭味化合物，对肉牛的生产性能的影响却不大；Salvo等[7]研究表明，在湿贮玉米中使用外源纤维酶可以提高肉牛的生产性能；Kung等[8]研究表明，使用丙酸和微生物混合接种时，可以改善湿贮玉米发酵品质和有氧稳定性。

在青贮过程中，空气的渗入对青贮饲料有很大的影响。Pitt等[9]认为，由于空气的渗入会造成每个月损失1%～3%的干物质；Woolford等[10]研究表明在青贮过程中空气的渗入可以引起青贮饲料的变质。Gerlach等[11]研究表明如果将变质的青贮饲料饲喂动物可以引起动物的生产性能下降甚至危害动物的生命，导致经济损失。然而Borreani等[12]研究指出在生产过程中很难阻止空气渗入到青贮饲料中,该现象主要有3种原因：一是由于青贮的低填充密度或者由于青贮原料自身的原因造成青贮窖中含有过多的氧气[13]；二是在饲喂阶段，青贮窖被打开，由于不能一次性的使用完整个青贮窖的青贮饲料，所以青贮饲料不可避免的与氧气发生接触[14]；三是由于青贮窖密封材料自身的透气性，造成青贮过程中氧气的不断渗入[15]。一种山梨酸钾、苯甲酸钠和亚硝酸钠组成的化学添加剂可以在青贮过程中有氧胁迫的条件下来改善青贮的发酵品质和提高有氧稳定性[16-17]。在湿贮玉米中也有相关研究Da Silva等[18]发现化学添加剂可以在相对较短的湿贮时间改善湿贮玉米的发酵品质和有氧稳定性。因此，本研究为探究苯甲酸钠、山梨酸钾和亚硝酸钠组成的化学添加剂能否消除湿贮期间氧气带来的负面影响，采用2种水分含量(35%，50%)，模拟3种湿贮期间有氧胁迫(前期有氧胁迫1～7 d，后期有氧胁迫22～28 d，全程有氧胁迫1～28 d)分别添加不同剂量(无添加，2 mL·kg-1，4 mL·kg-1)。

1 材料与方法1.1 湿贮玉米的调制与化学添加剂的制备

试验所用玉米种植于大庆市龙凤区保田村，品种为郑单958完熟期收获，收获后立即破碎。根据原料含水量，将灭菌蒸馏水均匀的喷洒在破碎的玉米上，使含水量分别为35%和50%，并将化学添加剂均匀的喷洒在玉米上。添加剂量分别为无添加(对照组)，2 mL·kg-1(添加组1)，4 mL·kg-1(添加组2)。使用容量为500 mL的白色聚乙烯罐进行湿贮。装填密度为，35%含水量湿贮玉米(DM) 715 kg·m-3，50%含水量湿贮玉米(DM)550 kg·m-3。湿贮时间为28 d，3个重复。苯甲酸钠、山梨酸钾、亚硝酸钠(分析纯级，均购自天津科密欧化学试剂有限公司)，按照固定比例4∶2∶1与灭菌蒸馏水混合并充分搅拌。

1.2 有氧胁迫处理

湿贮期间的有氧胁迫处理方法参照Kung等[19]处理的方法。在聚乙烯罐的盖子上钻一个直径为6 mm的孔，在聚乙烯罐两面分别钻一个直径为6 mm的孔，使两个孔之间呈180度，两孔之间的连线垂直于盖子上的孔。在非有氧胁迫期间使用内径为6 mm，外径为8 mm的丁基橡胶塞塞住，周围则使用中性硅酮耐候胶密封，在有氧胁迫期间则打开塞子，结束后使用中性硅酮耐候胶重新密封。在青贮罐的盖子上还连接有一个橡胶软管，软管另一端连接在装水的烧杯中，用于排除湿贮前期的气体，在软管上还有一个夹子，在第7 d后夹上夹子，避免空气进入。前期有氧胁迫处理(Early air stress，EAS)为湿贮的1～7 d，每天打开橡胶塞2 h，后期有氧胁迫处理(Later air stress，LAS)为22～28 d，每天打开橡胶塞2 h，全程有氧胁迫(Full air stress，FAS)为1～28 d，每天打开橡胶塞2 h。

1.3 测定指标及方法

将开封后和有氧暴露7 d后的湿贮玉米放置在65℃电热鼓风干燥箱(DGG-9240B，上海森信实验仪器有限公司)中48 h后取出，称量差值得出干物质含量。取开封后和有氧暴露7 d后的湿贮玉米样本20 g分别与180 mL灭菌生理盐水(0.85%)混合，并逐层稀释，进行微生物数量的检测。参考李金库等[20]文中的方法测定乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌数量(MRS培养基、VRBA培养基、PDA培养基购自青岛海博生物技术有限公司),使用电热恒温培养箱(DRP-9272，上海森信实验仪器有限公司)37℃培养48 h。取开封后和有氧暴露7天后的湿贮玉米，称取 20 g，加入180 mL的蒸馏水，混合均匀后用精密pH计(PSH-3C，上海虹益仪器仪表有限公司)测定pH并保留适量混合溶液。将保留的混合溶液，使用中速定性滤纸(102，杭州富阳北木浆有限公司)过滤过后，使用高效液相色谱法测定有机酸的含量。色谱条件为：高效液相色谱仪(SHI-MADZE-10A)，色谱柱为：Shodex Rspak KC 811 S -DVB gel Column 30 mm×8 mm，检测器：(SPD-M10AVP，流动相：3 mmol·L-1高氯酸，流速：1 mL·min-1；柱温 50℃，检测波长 210 nm，进样量5 μL)。

1.4 有氧稳定性的检测

将湿贮玉米样品放入1 L的聚乙烯罐中，罐口完全敞开，使用双层医用无菌纱布覆盖防止干燥和污染。将热电偶温度探头放置在样品的几何中心，使用温度记录仪(THTZ3208R，余姚市腾辉温控仪表厂)连续7 d每2 h测量一次室温和每个样品的温度。有氧稳定性被定义为样品温度比环境温度高2℃所用的时间[21]。

1.5 数据统计

使用Excel 2019 进行初步处理。采用SPSS 23 统计软件对数据进行单因素ANOVA分析，采用Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值”表示；均以(P<0.05)为差异显著性判断标准。采用SPSS 23 统计软件中一般线性模型单变量方差分析实现交互效应的方差分析，均以(P<0.05)为具有交互效应判断标准；以(P<0.01)为具有极显著交互效应判断标准。开封检测结果与有氧暴露7 d后检测结果，采用SPSS 23统计软件中成对样本T检验进行比较，求得双尾显著性，以“*”代表在(P<0.05)的水平上显著；“**”代表在(P0.05)无显著性。

2 结果2.1 破碎后玉米籽粒的特性

玉米籽粒的含水量为30.45%，水溶性碳水化合物为3.11%DM，pH值为5.98，乳酸菌、酵母菌、大肠杆菌的数量分别为6.42，5.33，3.73 lg cfu·g-1。

2.2 不同时期有氧胁迫下化学添加剂对湿贮玉米发酵品质的影响

不同添加剂量的化学添加剂和不同有氧胁迫处理对35%含水量湿贮玉米的干物质、pH、乳酸、乳酸菌和酵母菌均有显著影响，两者的交互作用对乳酸菌和酵母菌的数量有极显著影响，不同有氧胁迫处理对乙酸含量有显著影响(表1)。不同添加剂量处理中对照组的干物质含量显著低于添加组2，不同有氧胁迫处理中FAS处理的干物质显著低于EAS处理。不同添加剂量处理中对照组的pH显著高于添加组2，不同有氧胁迫处理中FAS处理的pH显著高于EAS和LAS处理。不同添加剂量处理中对照组的乳酸含量显著低于添加剂组，不同有氧胁迫处理中FAS处理的乳酸显著低于EAS处理。不同添加剂量处理对乙酸浓度无影响，在不同有氧胁迫处理中FAS和LAS处理对照组的乙酸显著低于EAS处理。不同添加剂量处理中对照组的乳酸菌数量显著低于添加组2，在不同有氧胁迫处理中，FAS处理的乳酸菌数量显著低于EAS处理。不同添加剂量处理中对照组的酵母菌数量显著高于添加组2，不同有氧胁迫处理中FAS处理的酵母菌数量显著高于EAS和LAS处理。大肠杆菌在不同有氧胁迫处理和不同添加剂剂量处理中均未检测出，故使用“<2”表示。

表1 不同时期有氧胁迫下35%含水量湿贮玉米发酵品质Table 1 Fermentation quality of wet storage maize at 35% moisture content under different periods of aerobic stress

不同剂量化学添加剂和不同有氧胁迫处理对50%含水量湿贮玉米的干物质、pH、乳酸、乳酸菌和酵母菌均有显著影响，两者的交互作用对干物质、pH和酵母菌有显著影响，不同剂量化学添加剂和不同有氧胁迫处理以及两者交互作用对乙酸无显著影响(表2)。不同添加剂量处理中对照组的干物质显著低于添加组2，不同有氧胁迫处理中FAS处理的干物质显著低于EAS和LAS处理。不同添加剂量处理中对照组的pH显著高于添加组2，不同有氧胁迫处理中FAS处理显著高于EAS和LAS处理。不同添加剂量处理中对照组的乳酸含量显著低于添加组2，不同有氧胁迫处理中FAS处理的乳酸含量显著低于EAS和LAS处理。不同有氧胁迫处理和不同添加剂剂量处理对乙酸含量无影响。不同添加剂量处理中对照组的乳酸菌数量显著低于添加组2，不同有氧胁迫处理中FAS处理的乳酸菌数量显著低于EAS和LAS处理。不同添加剂量处理中对照组的酵母菌数量显著高于添加组1和添加组2，不同有氧胁迫处理中FAS处理的酵母菌数量显著高于EAS和LAS处理。大肠杆菌在不同有氧胁迫处理和不同添加剂剂量处理中均为检测出，故使用“<2”表示。

表2 不同时期有氧胁迫下50%含水量湿贮玉米发酵品质Table 2 Fermentation quality of wet storage maize at 50% moisture content under different periods of aerobic stress

续表2

2.3 不同时期有氧胁迫下化学添加剂对湿贮玉米有氧稳定性的影响

表3可知，化学添加剂在两种含水量及不同有氧胁迫处理中均可以延长湿贮玉米的有氧稳定时间。添加组2除在35%含水量FAS处理外，其余处理中均达到168 h以上。

表3 2种含水量湿贮玉米的有氧稳定时间Table 3 Aerobic stabilization time of wet stored maize at 2 moisture contents

表4可知，不同有氧胁迫处理和不同化学添加剂剂量对有氧稳定性试验后35%含水量湿贮玉米的干物质、pH、乳酸菌和酵母菌有极显著影响，两者的交互作用对乳酸菌数量有极显著影响，不同化学添加剂剂量极显著影响了乳酸、乙酸和大肠杆菌数量。不同有氧胁迫处理的添加组2开封检测和有氧稳定性试验后的检测结果间的T-test检验均不显著。不同添加剂量处理中对照组的干物质显著低于添加组2，不同有氧胁迫处理中FAS处理的干物质显著低于EAS和LAS处理。不同添加剂量处理中对照组的pH显著高于添加组1和添加组2，不同有氧胁迫处理中FAS处理的pH显著高于EAS处理。在对照组中均未检测到乳酸和乙酸，在添加组中能够检测到乳酸和乙酸，且添加组1和添加组2间乳酸具有差异显著性，不同有氧胁迫处理间乳酸和乙酸不具有差异显著性。不同添加剂量处理中对照组的乳酸菌数量显著低于添加组2，不同有氧胁迫处理中FAS处理的乳酸菌数量显著低于EAS和LAS处理。不同添加剂量处理中对照组的酵母菌数量显著高于添加组2，不同有氧胁迫处理中FAS处理的酵母菌数量显著高于EAS处理。在不同添加剂剂量处理中，只有对照组检测出大肠杆菌，添加组1和添加组2中均未检测出。

表4 35%含水量湿贮玉米7 d有氧稳定试验后的发酵品质Table 4 Fermentation quality of wet stored maize at 35% moisture content after 7 d aerobic stabilization test

表5可知，不同有氧胁迫处理和不同化学添加剂剂量对有氧稳定性试验后50%含水量湿贮玉米的干物质、pH、乳酸、乙酸、乳酸菌、酵母菌和大肠杆菌数量有显著影响，两者交互作用对pH、乳酸、乙酸、酵母菌和大肠杆菌有显著影响。不同有氧胁迫处理的添加组2开封检测和有氧稳定性试验后的检测结果间的T-test检验均不显著。不同添加剂量处理中对照组的干物质显著低于添加组2，不同有氧胁迫处理中FAS处理的干物质显著低于EAS处理。不同添加剂量处理中对照组的pH显著高于添加组1和添加组2，不同有氧胁迫处理中FAS处理显著高于EAS和LAS处理。在照组中均未检测出乳酸和乙酸，在添加组1和添加组2中均检测到乳酸和乙酸，且添加组1和添加2具有差异显著性，EAS处理和FAS处理相比，能够提高不同添加剂剂量的乳酸和乙酸含量。不同添加剂量处理中对照组的酵母菌数量显著高于添加组2，不同有氧胁迫处理中FAS处理中酵母菌数量显著高于EAS处理。在不同有氧胁迫处理中，添加组2均未检测出大肠杆菌，EAS处理和FAS处理相比，能够显著减少大肠杆菌的数量。

表5 50%含水量湿贮玉米7 d有氧稳定试验后的发酵品质Table 5 Fermentation quality of wet stored maize at 50% moisture content after 7 d aerobic stabilization test

3 讨论3.1 不同时期有氧胁迫处理对湿贮玉米发酵品质和有氧稳定性的影响

良好的厌氧环境不仅有利于乳酸菌的生长，还能抑制酵母菌等好氧细菌的生长，进而减少湿贮过程中干物质损失[22]。本研究发现3种有氧胁迫处理中，对湿贮玉米发酵品质和有氧稳定性负面影响最大的是全程有氧胁迫处理，这与Kim等[23]的研究结果相似。原因可能是在整个湿贮期都有氧气的介入，不利于厌氧细菌的生长，使得好氧细菌和厌氧细菌长期存在竞争；也有可能是全程有氧胁迫处理使湿贮玉米中的氧气并没有被耗尽，原料中附着的好氧细菌活动仍然活跃，湿贮玉米始终处于或较长时间处于青贮微生物变化过程中的第一阶段，即有氧阶段[24]。3种有氧胁迫处理中，对湿贮玉米发酵品质和有氧稳定性负面影响最小是前期有氧胁迫处理。前期有氧胁迫处理与后期有氧胁迫处理和全程有氧胁迫处理相比负面影响最小原因可能是湿贮期间只有前期有氧气的介入，厌氧环境比较良好，乳酸菌可以在前期有氧胁迫处理后迅速增殖并占据主导地位，产生和积累乳酸和乙酸[25]。另一种原因可能是，在前期有氧胁迫处理后氧气不在再入湿贮玉米中，使得原料附着的好氧细菌被抑制，湿贮玉米能够顺利的进入青贮微生物变化过程中的第二阶段，即厌氧发酵阶段[26]。

3.2 不同剂量化学添加剂对有氧胁迫下湿贮玉米的发酵品质和有氧稳定性的影响

与对照组相比，4 mL·kg-1化学添加剂可以减少湿贮期间有氧胁迫带来的负面影响。在Naiara等[27]研究表明，添加组的干物质和乳酸菌都高于对照组，Teller等[28]研究表明添加组的乙酸含量与对照组差异不显著，这与本研究的结果相似。Silva等[18]研究表明添加组的酵母菌与对照组差异不显著，这和本研究的结果不同，造成这样的现象很可能是由于有氧胁迫处理所导致的。具体的说，这种化学添加剂不会对琼脂平板酵母菌计数的结果带来影响，但是会改变酵母菌组成的种类[18]，在本研究中有氧胁迫的处理可能造成了化学添加剂改变酵母菌种类的能力变弱，同时有氧胁迫处理又刺激了酵母菌的生长，因此，造成本研究中化学添加剂对酵母菌的显著影响。尽管青贮期间的有氧胁迫处理会使青贮饲料的有氧稳定性变差，除35%含水量FAS处理组外所有的添加组2有氧稳定时间都在168 h以上，这与kung等[14]的研究结果相似。化学添加剂延长湿贮玉米的有氧稳定性，原因可能是对好氧细菌代谢的抑制作用。Morassi等[29]研究中证实了苯甲酸对细胞壁代谢相关酶有抑制的作用，Ostergaard等[30]研究中证实山梨酸可以抑制酵母菌细胞膜的代谢，陈瑶等[31]研究也证实了亚硝酸盐可以阻断好氧细胞的氧传输和氧化磷酸化。在本研究证实了化学添加剂能够抑制酵母菌和大肠杆菌，虽然在开封检测中对照组未检测到大肠杆菌，但在有氧稳定性检测中可明显发现化学添加剂对大肠杆菌的抑制作用。

4 结论

苯甲酸钠、山梨酸钾和亚硝酸盐组成的化学添加剂的添加剂量为4 mL·kg-1时，能够明显消除有氧胁迫带来负面影响，可以显著减少干物质的损失、显著降低pH、显著促进乳酸菌生长和乳酸的积累以及提高有氧稳定性。