紫花苜蓿胚性愈伤组织诱导与增殖的研究

摘要：为在不同栽培苜蓿（Medicago sativa）品种上，建立稳定、快速且高效的组织培养体系，本试验以品种游客、Paola和Sardi7为研究材料，探究了苜蓿外植体、激素配比及金属离子（Cu2+、Ag+），对其胚性愈伤组织的诱导效果。结果表明：下胚轴为诱导愈伤组织的最佳外植体；MS+1 mg·L-12，4-D+0.2 mg·L-1 KT为培养基时游客和Paola胚性愈伤诱导率分别为24.7%，16.7%；MS+2 mg·L-12，4-D+0.2 mg·L-1 KT为培养基时Sardi7胚性愈伤诱导效果最佳为27.3%；1 μmol·L-1 和5 μmol·L-1 Cu2+均能显著促进Sardi7游客和Paola愈伤组织的诱导；5 μmol·L-1 Ag+显著诱导游客和Paola形成胚性愈伤组织，诱导率分别提高25.3%，46.7%（Plt;0.05）。本研究探索了诱导苜蓿愈伤组织的最佳外植体及其培养条件、金属离子促进不同苜蓿品种再生的作用，为突破同源四倍体栽培苜蓿品种基因型上的限制、提高胚性愈伤组织出愈率提供了思路。

关键词：紫花苜蓿；下胚轴；金属离子；胚性愈伤；显微观察

中图分类号：Q945.79文献标识码：A文章编号：1007-0435（2023）04-1057-07

Induction and Proliferation of Embryogenic Callus of Alfalfa

TAN Lu-na#， PENG Jia-wen#， XU Huan-yu， ZHANG Han-wen， XIA Hou-yin， MIAO Yu-qi，

CUI Yi-lin， YUAN Wang， MA Zhi-chao， TONG Yu-tao， GAO Jing-hui*

（College of Grass and Grassland， Northwest A amp; F University， Yangling， Shaanxi Province 712100， China）

Abstract：In order to establish a stable，rapid and efficient tissue culture system on different cultivated alfalfa （Medicago sativa） varieties，this experiment took the varieties TouristPaola and Sardi7 as the research materials，investigated the effects of alfalfa explants，hormones ratio and metal ions （Cu2+，Ag+） on induction of embryonic callus. The results showed that hypocotyl was the best explants to induce callus. When MS+1 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 KT were cultured，embryogenic callus induction rates of Tourist and Paola were 24.7% and 16.7% respectively. And the embryogenic callus induction effect of Sardi7 was 27.3% when MS+2 mg·L-1 2，4-D +0.2 mg·L-1 KT were cultured. 1 μmol·L-1 and 5 μmol·L-1 Cu2+ could promote callus induction of Sardi7，Tourist and Paola significantly. 5 μmol·L-1 Ag+ significantly induced embryogenic callus of Tourist and Paola，and the induction rates increased by 25.3% and 46.7%，respectively （Plt;0.05）. In this study，we explored the best explants to induce alfalfa callus and their culture conditions，as well as the role of metal ions in promoting regeneration of different alfalfa varieties，which provided a solution for breaking through the genotypic restriction of autotetraploid cultivated alfalfa varieties and improving the healing rate of embryonic callus.

Key words：Alfalfa （Medicago sativa）;Hypocotyl;Metal ions;Embryogenic callus;Microscopic observation

优质饲料草种紫花苜蓿（Medicago sativa）的遗传转化工作中，因组织培养过程中植株再生率低、转化效率不稳定，严重制约了转基因及相关遗传改良工作的进展［1］。Chen等［2］已完成了同源四倍体紫花苜蓿新疆大叶的测序工作，为苜蓿的遗传改良奠定了良好的基础。因此，获取可用于不同栽培苜蓿品种的稳定、快速且高效的组织培养体系用于遗传转化研究，已成为当前紫花苜蓿分子育种的重中之重。

诱导和增殖高质量愈伤组织对高效紫花苜蓿组织培养体系的建立至关重要；其中胚性愈伤组织生长较快，可通过体细胞胚胎发生形成植株［3］；而非胚性愈伤组织则生长缓慢，再生能力比较弱。近年来，许多学者通过探究紫花苜蓿的外植体种类和激素浓度配比，提高胚性愈伤组织诱导率并建立高效组织培养体系；如MS培养基中，2，4-D与6-BA不同配伍，可诱导苜蓿种子［4］、胚轴上、下段和子叶［5］形成愈伤组织。Cu2+参与植物生长发育过程中的多种代谢反应，是多种氧化酶的组成成分、参与植物体内的氧化还原过程和光合作用［6］，在植物组织培养中起重要作用［7］；Ag+对许多单子叶和双子叶植物形态发生具有促进作用，作为一种乙烯抑制剂能减轻植物自身产生乙烯对分化的抑制作用，促进外植体形态发生［8-10］。在小麦组培中添加10 μmol·L-1 Cu2+时，愈伤诱导率和胚性愈伤诱导率均显著提高［11］；Ag+对甘蔗试管苗繁殖存一定的影响和应用［12］。本试验以紫花苜蓿游客的子叶、根尖和下胚轴为外植体诱导愈伤组织，探索诱导苜蓿愈伤组织的最佳外植体及其培养条件；并利用Cu2+和Ag+刺激苜蓿胚性愈伤组织形成、提高愈伤组织出愈率的可能，探索金属离子促进不同苜蓿品种再生的作用；以期突破紫花苜蓿再生体系效率较低的难题，达到不同品种紫花苜蓿均可通过愈伤组织培养再生植株的目的。

1材料和方法

1.1材料

试验材料为紫花苜蓿品种Sardi7游客和Paola，购置于百绿（天津）国际草业有限公司。

1.2方法

1.2.1无菌苗培养取紫花苜蓿游客种子100～150粒，在超净工作台内30% NaClO浸泡消毒20 min；无菌水洗涤3次并用无菌滤纸吸干种子表面残留水分，接种至1/2MS培养基（添加琼脂12 g·L-1、蔗糖10 g·L-1，pH 5.7）。置于光照培养箱中培养，培养条件为：25±2℃，光照18 h /黑暗6 h，光照强度2 000 lx。本试验中后续组织培养的温度和光照条件均如上所述。

1.2.2紫花苜蓿不同外植体愈伤组织的获得取培养3～4 d 游客无菌苗，将子叶切割成5 mm正方形小块，下胚轴和根尖切割成5 mm长小段，接种到下列4种不同激素组合，含有蔗糖30 g·L-1和琼脂10 g·L-1，pH 5.8的MS培养基中，见表1。在方形培养皿中分别接种子叶、下胚轴及根3种不同外植体50个，每种激素组合处理重复3次。接种14 d后观察愈伤组织形态，统计愈伤组织的数量并分析结果。

1.2.3不同品种的紫花苜蓿胚性愈伤组织的获得将紫花苜蓿品种Sardi7、游客和Paola3个品种的下胚轴分别按照上述诱导培养基激素组合培养基进行外植体制备，14 d后获得的愈伤组织转置于相同激素浓度配比诱导培养基上进行胚性愈伤诱导培养，每14 d继代1次，共继代2次。继代培养完成后根据愈伤组织的形态划分为三类［13-14］：Ⅰ型为淡黄色愈伤组织，结构松散透明、质地较软，镊子触碰容易破碎，无紧密结构；Ⅱ型为绿色愈伤组织，表面呈现绿色颗粒状，质地紧密坚硬，镊子触碰不会破碎，属于胚性愈伤组织；Ⅲ型为褐色愈伤组织，质地紧密，整体呈现干枯状，镊子触碰不易破碎。

1.2.4金属离子浓度设置根据上述愈伤组织的形态筛选出适宜诱导胚性愈伤组织的最佳激素组合，并在其中分别添加不同浓度梯度的Cu2+、Ag+（表2）。将紫花苜蓿品种Sardi7游客和Paola3个品种的下胚轴在最佳激素组合培养基诱导14 d后获得的愈伤组织，转置于上述添加了金属离子的培养基上继代培养。继代培养完成后，统计胚性愈伤组织数量和愈伤组织数量。愈伤组织诱导率=产生愈伤组织数／接种外植体总数×100%；胚性愈伤诱导率=产生Ⅱ型愈伤组织数/接种外植体总数×100%。

1.2.5显微观察- HE染色法将紫花苜蓿游客继代两次后的3种不同类型愈伤组织浸入70% FAA固定液（甲醛∶乙酸∶70%乙醇=5∶5∶90）中固定24 h，以不同浓度梯度乙醇（70%，85%，95%，100%）将固定样品脱水后浸蜡并包埋在石蜡中，切片机切成厚度5 μm的蜡带后制片，过苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin Staining）染色并拍照观察。

1.3数据分析

用Excel 2016记录整理试验数据，GraphPad Prism 8作图。方差分析采用SPSS 23进行，单因素ANOVA分析愈伤组织诱导率和胚性愈伤诱导率，显著性比较用Duncans法，多重比较采用新复极差法。

2结果与分析

2.1紫花苜蓿诱导愈伤组织的外植体及激素浓度配比

紫花苜蓿游客不同取材部位获得的外植体在不同激素浓度配比下的愈伤诱导率有显著差异（图1 A）。4种不同激素浓度组合下，以下胚轴为外植体时的愈伤诱导率均最高，激素浓度配比为Y1和Y4时差异最为显著；Y1激素浓度配比下，下胚轴愈伤诱导率为66.0%，较子叶和根尖高出29.0%，45.7%（Plt;0.05）；Y4激素浓度配比下，下胚轴愈伤诱导率为75.8%，较子叶和根尖高出38.8%，33.9%（Plt;0.05）。Y1激素浓度配比下胚轴诱导形成的愈伤组织呈现出绿色、表面颗粒状、质地紧密坚硬的形态（图1 B，a）。在4种不同激素浓度组合下子叶和根尖均不能形成形态较好的愈伤组织：子叶为外植体形成的愈伤组织有水渍褐化现象，较难形成胚性愈伤组织（图1 B，b）；根尖呈现水渍、透亮不紧密形态，愈伤组织较难保持良好（图1 B，c）。以下胚轴为外植体时在激素浓度配比为Y1、Y3和Y4时愈伤诱导率显著高于Y2，分别高出66.2%，75.1%，75.8%（Plt;0.05）。因此紫花苜蓿下胚轴为愈伤诱导的最佳外植体，适宜诱导的培养基激素浓度组合为Y1，Y3和Y4。

2.2不同激素浓度配比对不同品种紫花苜蓿胚性愈伤组织的诱导

将紫花苜蓿品种Sardi7游客和Paola3个品种下胚轴诱导形成的愈伤组织两次继代培养后，不同品种紫花苜蓿诱导胚性愈伤组织的最适激素浓度配比不同（图2）。Sardi7诱导胚性愈伤组织最适激素浓度配比为Y3，该配方下的胚性愈伤诱导率为27.3%；显著高于Y1，Y4，较Y1，Y4分别高出6.0%，16.7%（Plt;0.05）。在Paola中，Y1和Y3激素浓度配比下胚性愈伤诱导率都较高，胚性愈伤诱导率为16.7%，12.7%。游客诱导胚性愈伤组织最适激素浓度为Y1，胚性愈伤诱导率达24.7%，显著高于Y3，Y4下的胚性愈伤诱导率，分别高出了16.0%，18.3%（Plt;0.05）。

2.3金属离子对紫花苜蓿愈伤诱导的作用

在培养基中添加Cu2+后，3个供试品种的愈伤诱导率均显著增加（表3）。Paola的愈伤诱导率在1 μmol·L-1Cu2+浓度下最高，达86.7%，比对照组高20.0%（Plt;0.05）；游客和Sardi7的愈伤诱导率在5 μmol·L-1 Cu2+浓度下最高，分别高达92.0%，92.7%，较对照组高出14.0%，12.0%（Plt;0.05）。添加Ag+可以显著提高Paola的愈伤诱导率，对Sardi7、游客的愈伤诱导无显著影响（表3）。5 μmol·L-1和10 μmol·L-1 Ag+浓度下Paola的愈伤诱导率较对照显著提高，分别为94.7%，84.0%，较对照组分别高出28.0%，17.3%（Plt;0.05）。

添加Cu2+后Paola游客的胚性愈伤组织诱导率显著提高，最高可达29.3%，21.3%，分别比对照组高16.6%，12.6%（Plt;0.05）；供试品种Sardi7在1 μmol·L-1和5 μmol·L-1 Cu2+浓度下的胚性愈伤诱导率与对照组的胚性愈伤诱导率均无显著差异（P＞0.05）。Ag+浓度可显著提高Paola、游客的胚性愈伤诱导率，对Sardi7的胚性愈伤组织诱导无显著促进作用；Paola游客的胚性愈伤诱导率在5 μmol·L-1 Ag+浓度下最高，高达59.3%，34.00%，较对照组提高了46.7%，25.3%（Plt;0.05）。

2.4紫花苜蓿愈伤组织的形态结构

2.4.1愈伤组织形态对紫花苜蓿游客的下胚轴在两次继代培养后进行形态学观察，松散透明的Ⅰ型愈伤组织分散性较好，随着培养时间的增加不容易发生褐化，但无法形成胚性组织，不能继续分化过程；Ⅱ型致密绿色愈伤组织质地较硬，再生性高，增殖较快；Ⅲ型褐化愈伤组织随着培养时间增长，逐渐丧失胚性而死亡。在Y3配方中加入金属离子后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型紫花苜蓿愈伤组织更加紧密、表面颗粒状增多（图3B，3D，3F）。

2.4.2组织学特征在显微组织细胞学上，紫花苜蓿游客胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织有明显的差异（图4）。Ⅰ型松散透明淡黄色愈伤组织的细胞排列松散，无明显的组织结构，且细胞染色浅，较少的细胞含有细胞核（图4A，B）；Ⅱ型致密的绿色愈伤组织细胞排列紧密，有明显的组织样结构和分生中心，分化出球形胚和子叶型胚结构（图4 C），且细胞染色深，细胞核大（图4D）；Ⅲ型褐色愈伤组织细胞排列杂乱，没有明显的组织结构，虽然细胞染色较深，部分细胞有细核，但细胞结构不完整（图4E，4F）。

3讨论

3.1外植体类型及激素浓度影响紫花苜蓿胚性愈伤的形成

紫花苜蓿不同植株部位内源激素水平的差异，同一品种上的不同外植体，诱导产生愈伤组织的效果存在显著差异［15，16］，适宜外植体有助于高质量愈伤组织的形成，保证其继代培养中不定芽的形成，有利于发育成完整植株，提高组培效率［17］。本研究中采用紫花苜蓿游客品种子叶、下胚轴和根尖3种不同外植体，在愈伤组织诱导上存在着显著差异，其中以下胚轴作为外植体形成愈伤组织数量和质量效果最佳，研究结果与赵晓倩等［18-19］的研究结果一致。

马伶俐等［20］在MS基本培养基上以下胚轴为外植体，添加2 mg·L-1 2，4-D+1 mg·L-1 6-BA激素，诱导紫花苜蓿甘农4号愈伤组织并分化成苗；紫花苜蓿青大1号以种子为外植体，在添加了40 μmol·L-1 2，4-D和15 μmol·L-1 6-BA的MS培养基上诱导出胚性愈伤组织［21］。基因型决定植物体细胞胚胎发生及其发育，相同物种不同基因型的体细胞胚发生能力存在差异［22］，对植物激素种类和浓度敏感性响应亦不同［23］。本试验中采用下胚轴为外植体，品种Paola和游客在激素浓度配比为2，4-D 1 mg·L-1+ KT 0.2 mg·L-1时胚性愈伤诱导效果最佳，而品种Sardi7诱导胚性愈伤组织的最佳激素浓度则为2，4-D 2 mg·L-1+ KT 0.2 mg·L-1。以紫花苜蓿叶片为外植体，2 mg·L-1 2，4-D和0.5 mg/ KT最适于胚性愈伤的诱导，但也仅适用于基因型为公农系列苜蓿品种；因不同基因型次生胚发生频率不同，不同品种紫花苜蓿胚性愈伤组织最适激素浓度配伍存在差异［24］，因此，选择合适的外植体类型和激素配伍，可以有效提高胚性愈伤诱导率。不同品种紫花苜蓿诱导胚性愈伤组织，需要在外植体和激素配伍间多次试验探索，以期获得较好的再生植株。

3.2金属离子促进紫花苜蓿胚性愈伤组织诱导

金属离子会对植物愈伤诱导产生显著影响［25］，Cu2+因其氧化还原特性能够参与生物体内的多种催化反应，对生物的正常生长和发育至关重要［26］；Ag+作为植物生长非必需元素，对器官和体细胞胚胎发生具有显著促进作用［12］。山禾等［27］发现在培养基中添加15.0 μmol·L-1的Cu2+，寒地粳稻空育131和东农425的愈伤组织诱导率分别提高了8.0%和22.0%（Plt;0.01），绿苗分化率分别提高了26.4%和27.0%（Plt;0.05）；在小麦甘春中添加0.5 μmol·L-1的CuSO4有类似效应［28］。本试验研究0～5 μmol·L-1 Cu2+和 0～10 μmol·L-1 Ag+对紫花苜蓿愈伤诱导的效应，1 μmol·L-1和5 μmol·L-1Cu2+均能显著提高3种紫花苜蓿愈伤组织诱导率。棉花组培中添加5 μmol·L-1 Ag+可缩短最早出愈天数，提高愈伤诱导率和植株再生率［25］；当添加10 μmol·L-1Ag+时，小麦泰山21的胚性愈伤组织诱导率最高可达到74.0%［29］。本实验中Cu2+和Ag+均不同程度促进紫花苜蓿愈伤的诱导，这与后猛等［29］在小麦上的研究结果一致；其中5 μmol·L-1 Ag+显著提高Paola和游客胚性愈伤组织的诱导率。试验添加1 μmol·L-1和5 μmol·L-1 Cu2+促进了紫花苜蓿愈伤诱导率，但对胚性愈伤诱导效果则尚需进一步研究。

3.3金属离子影响紫花苜蓿胚性愈伤形态

高浓度的Ag+通过严重的氧化应激引起形态畸变和细胞膜损伤，从而对愈伤组织诱导产生负效应［30］。本研究中紫花苜蓿游客3种愈伤组织形态学观察表明，诱导的紫花苜蓿胚性愈伤组织具有致密的绿色颗粒状结构，在细胞学形态上具有明显的分生中心，并形成了球状胚和子叶型胚的胚状结构，与连香树［31］和凤丹白［32］组培上的研究结果相一致。受紫花苜蓿基因型的影响，本研究添加Ag+的愈伤组织形态学观察发现，形成的愈伤组织更加紧密、表面颗粒状增多，说明Ag+对紫花苜蓿胚性愈伤品质有明显促进作用，并可实现在紫花苜蓿胚性愈伤组织早期组织学形态鉴定，便于早期优质胚性愈伤组织的筛选。

如何突破同源四倍体栽培苜蓿品种基因型上的限制、提高胚性愈伤组织出愈率，金属离子在胚性愈伤组织形态上的作用，也许能提供一些思路。玉米中报道了ZmSAUR15 基因参与吲哚-3-乙酸的生物合成和未成熟胚衍生愈伤组织的细胞分裂，敲除ZmSAUR15可以改善未成熟胚胎诱导胚性愈伤组织形成的能力，从而提高愈伤组织再生效率［33］。而金属离子在苜蓿胚性愈伤组织诱导中的分子机理则有待进一步研究。

4结论

紫花苜蓿游客的下胚轴作为外植体能够很好地诱导愈伤组织的形成；游客和Paola胚性愈伤诱导率均较高的培养基为MS+1 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 KT，诱导率分别为24.67%，16.67%；Sardi7的胚性愈伤诱导效果最佳的培养基为MS+2 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 KT，诱导率为27.33%；1 μmol·L-1和5 μmol·L-1 Cu2+均能促进Sardi7游客和Paola愈伤组织的诱导，其中Paola的愈伤诱导率在1 μmol·L-1 Cu2+浓度下最高，为86.7%，游客和Sardi7的愈伤诱导率在5 μmol·L-1 Cu2+浓度下最高，分别为92.0%，92.7%；5 μmol·L-1 Ag+显著提高了游客和Paola的胚性愈伤诱导率，较不添加Ag+的对照组分别提高了25.3%，46.7%（Plt;0.05）。

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（责任编辑 彭露茜）