农牧交错带草地生态系统N2O通量对短期氮、磷添加的响应

燕学东， 陈晓鹏， 郝 杰， 刁华杰， 李红玉， 董宽虎*， 王常慧*

(1.山西农业大学草业学院， 山西 太谷 030801； 2.草地生态保护与乡土草种质创新山西省重点实验室， 山西 太谷 030801； 3.山西右玉黄土高原草地生态系统国家定位观测研究站， 山西 右玉 037200；4.山西农业大学科研管理部， 山西 太谷 030801)

农牧交错带是我国北方重要的草牧业生产基地和生态屏障，面积约6.5×105hm2，占全国总土地面积的6.8%[1-2]，在调节气候变化和氮素生物地球化学循环过程中发挥着重要的作用[3-4]。农牧交错带草地生态系统受农业和牧业的双重影响，自然氮沉降高于牧区天然草地[5-6]，属于典型脆弱生态系统。氮和磷在维持草地生态系统生产力方面发挥着重要作用。随着我国经济的快速发展，大气氮沉降对生态系统的危害日益增大，进而缓解草地的氮限制，影响植物生产力。氮沉降引起的磷限制在磷添加处理下是否会得到改善研究尚不清晰，因此，研究氮、磷及其交互作用对草地生态系统的影响具有重要意义。

氧化亚氮(N2O)作为一种增温潜能大且在大气中滞留时间长的重要温室气体，在全球气温升高方面具有不可忽略的作用[7]。草地生态系统是N2O重要排放源，受土壤无机氮库、土壤微生物等多种生物和非生物因子的影响；在藏北高寒草甸的研究发现，随着氮添加量的增加，土壤无机氮含量增加，微生物活性增强，导致N2O释放升高[11]，但随着氮输入增加，满足植物需求之后土壤中的氮达到饱和，更多的氮可能被硝化细菌和反硝化细菌利用。此外，根系分泌物可能进一步刺激土壤异养微生物活动，从而导致N2O排放的增长呈指数增加[12]；除了氮富集影响N2O排放，磷的富集目前也已被发现可以降低高寒草甸土壤中硝酸盐还原菌和氨氧化古菌(AOA)的丰度，并增加了N2O还原菌的丰度从而减少了N2O的排放，因此，磷的影响对土壤N2O排放的全球评估也是非常重要的[13]；但是，在亚高山草甸的研究发现氮、磷添加对N2O排放并没有显著的交互作用[14-15]，因此，氮、磷的交互作用如何影响土壤N2O排放目前还不明确，尤其在农牧交错带草地生态系统N2O通量对氮磷富集的响应。

本研究依托山西右玉黄土高原草地生态系统国家定位观测研究站2017年建立的养分添加(氮、磷)实验平台[16]，通过监测N2O排放通量，探究N2O排放的季节动态和年际差异，另外通过测定植物生产力，土壤无机氮库，土壤微生物生物量等相关生物和非生物因子，探究氮、磷及其交互作用对农牧交错带草地N2O通量的影响，明确主要影响因子及作用机理，为农牧交错带草地科学管理提供理论依据。

1 材料与方法1.1 试验地概况

试验地位于山西右玉黄土高原草地生态系统国家定位观测研究站(39°5917″N，112°1917″E)，海拔1 348 m，属于温带大陆性季风气候。冬季寒冷漫长，春季干燥多风，气温回升快，夏季温凉多雨，秋季凉爽干燥[17]，2018与2019年均气温分别为4.84℃和4.69℃，最冷月1月，最热月7月，终霜期在5月初，初霜期为9月上、中旬，无霜期100～120天。全年太阳总辐射量598 kJ·cm-2，2018与2019年降水量409.09 mm和311.20 mm，气候为温带大陆性季风气候，土壤机械组成为砂质壤土，类型为栗钙土，土壤pH为9.0±0.05，土壤交换性阳离子K+，Ca2+，Na+，Mg2+分别是(83±3.7) mg·kg-1，(1 809±58) mg·kg-1，(250±22) mg·kg-1，和(93±16) mg·kg-1。另外，土壤全氮，全磷，有机碳，速效钾，速效磷含量分别为(0.80±0.02) g·kg-1，(0.39±0.01) g·kg-1，(5.43±0.16) g·kg-1，(131.59±4.34) mg·kg-1，(3.39±0.09) mg·kg-1(2017年本底测定值)。草地植被以赖草(Leymussecalinus)优势种，其他伴生种碱茅(Puccinelliadistans)、草地风毛菊(Saussureaamara)、鹅绒萎陵菜(Potentillaansrina)、西伯利亚蓼(Polygonumsibiricum)、碱蒿(Artemisiaanethifolia)、长叶碱毛茛(Halerpestesruthenica)等[18]。

1.2 试验设计

本研究依托2017年建立的全球变化联网试验多养分(氮、磷)添加平台(Nutrient Network)[19]。试验采用完全随机区组设计，设置对照(CK)、氮添加(N)、磷添加(P)以及氮、磷同时添加(NP)4个处理，每个处理6个重复，小区面积为6 m × 6 m，小区间隔2 m，氮、磷的添加形式分别为缓释尿素[CO(NH2)2]和[Ca(H2PO4)2]，添加量均为10 g·m-2·a-1。实验处理从2018年开始，每年5月初将[CO(NH2)2]和[Ca(H2PO4)2]与杀菌的细沙混匀后一次性均匀的撒在样地中。

1.3 观测指标与方法

1.3.1N2O通量的测定 N2O通量监测采用静态暗箱-气相色谱法[18]。静态箱采用不锈钢暗箱和底座构成，暗箱长40 cm×宽40 cm×高25 cm，外部配有保温层，防止静态箱内温度大幅度变化，箱顶部有取气软管和温度探测口，箱内安装小型风扇用以混合箱内气体。底座长40 cm×宽40 cm×高10 cm，底座顶部焊接有一个2 cm高的水槽于2017年布置在小区中。取样时，将暗箱和底座连接，水槽注水封好，使两箱间气路密闭。

2018年和2019年生长季(5—9月)每两周取1次气体，每次取样在天气晴朗的上午08:00—12:00进行。用100 mL一次性塑料注射器连通静态暗箱顶部的取气软管，在40 min内每隔10 min分别用注射器抽取100 mL气体，注入已准备好的铝箔真空气袋内保存，带回实验室后，在一周内使用气相色谱仪(Agilent 7890B)分析N2O浓度，采用电子捕获检测器(ECD)在350℃时测定N2O浓度并计算气体通量[20]，N2O浓度和通量计算公式分别为：

N2O浓度计算公式：Cs=As×CO÷AO

上式中，Cs：N2O浓度；CO：标气浓度(276 ppm)；As：所测样品峰面积；AO：标气峰面积。

气体通量计算公式：F=dc/dt×M/ Vo×P/Po×T/To×V/A

上式中，F为N2O通量，单位为[μg·m-2·h-1]；M为N2O的摩尔质量(g·mol-1)；V为静态箱箱内空气体积(L)；A为静态箱底面积(m2)；dc/dt代表N2O浓度随时间变化的直线斜率；Vo，To和Po分别为标准状态下N2O的摩尔体积(22.4 L·mol-1)、空气绝对温度(273.15 K)和气压(101.325 kPa)；P为采样地点的气压；T为采样时箱内的绝对温度[21]。

1.3.2气象因子测定 大气温度(℃)和降雨量(mm)采用小型气象站每小时测定4次(HOBO U30，美国，ONSET)。在每次采集气体时，分别用数字显示温度计和TDR-300土壤水分测定仪测量地表0～5 cm处实时土壤温度(Soil temperature,ST)和土壤含水量(Soil moisture content,SM)，每月测定2次。

1.3.3植被地上生物量、土壤无机氮和微生物生物量碳氮的测定 2018年和2019年的8月中旬，在每个样地内随机选取2个0.2 m×1 m的样方，用剪刀分种将样方内的植物齐地面剪取后装入信封内，同时，用手工捡取的方法分离凋落物(Litter)，带回实验室，105℃下30 min杀青，65℃烘至恒重(48 h)，用1/100天平称量，计算各小区的地上生物量(Aboveground biomass，AGB/g·m-2)。

在测定地上生物量的样方内随机选取3个点，用直径3 cm土钻取0-10 cm的土壤样品，过2 mm筛去除细根及杂质后，在4℃冷藏保存待测。可溶性有机碳(DOC)含量和可溶性有机氮(DON)经过0.5 mol·L-1的K2SO4浸提后用TOC分析仪(Elementar TOC,Elementar Co,Hanau,Germany)测定；微生物生物量碳(MBC)和微生物生物量氮(MBN)采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法，用TOC分析仪测定，计算公式参照Vance等(1987)的方法[22]；土壤中的硝态氮和铵态氮含量用K2SO4浸提法，用全自动微量流动分析仪(Auto Analyzer 3,SEAL,Germany)测定。

1.4 数据处理

2 结果与分析2.1 生长季大气温度和降雨量

2018年和2019年生长季大气温度呈季节动态变化(图1)。2018年生长季的降雨量为460.8 mm，主要集中在7月(202.8 mm)和8月(137.4 mm)；2019年生长季降雨量为255.6 mm。2018年的生长季平均大气气温为16.91℃，最高温和最低温分别在8月(24.50℃)和9月(5.62℃)，2019年的生长季平均大气温度为16.01℃，7月温度最高(23.19℃)。

图1 2018-2019年生长季大气温度及降雨量的季节动态Fig.1 The seasonal variation of air temperature and precipitation during 2018-2019 growing seasons

2.2 氮、磷添加对土壤温度和土壤含水量的影响

2018和2019年生长季5—9月0～5 cm土壤温度呈双峰型波动趋势，其波动范围分别为11.78℃～22.68℃和9.00℃～21.88℃(图2a)。2018年和2019年各处理间生长季0～5 cm土壤温度无显著差异(图2b)。三因素重复测量方差分析结果显示，P添加显著降低了土壤温度(P<0.05)，生长季土壤温度在年际间存在显著差异(P<0.001，表1)。

图2 2018-2019年生长季土壤温度和土壤含水量的季节动态Fig.2 The seasonal variation of soil temperature and soil moisture content during the growing seasons of 2018 and 2019注：图a和c分别为土壤温度和土壤含水量动态，b和d分别为土壤平均温度和土壤平均含水量。图中CK，N，P，NP分别表示对照，氮添加，磷添加，氮、磷同时添加四个处理。下同Note：Figures a and c show the dynamics of soil temperature and soil moisture content,respectively,and b and d show the average soil temperature and the average soil moisture content,respectively. CK,N,P,and NP in the figure represent the four treatments of control,nitrogen addition,phosphorus addition,and simultaneous nitrogen and phosphorus addition,respectively. The same as below

表1 处理年份、氮、磷添加及其交互作用对N2O通量(N2O)、土壤温度(ST)、土壤含水量(SM)影响的三因素方差分析结果Table 1 Results (F value) of Three-way ANOVA testing the effects of year,nitrogen addition,phosphorus addition and their interaction on N2O flux,soil temperature,soil moisture content in semiarid grassland

2018和2019年生长季5—9月0～5 cm土壤含水量波动较大，其波动范围分别为6.6%～22.2%和10.4%～31.0%(图2c)。2018年和2019年各处理间生长季0～5 cm土壤含水量无显著差异(图2 d)，2018年土壤含水量显著低于2019年(P<0.05，表1)。

2.3 氮、磷添加对N2O通量的影响

2018年和2019年，N2O通量呈季节动态变化，其波动范围分别为1.34～56.32 μg·m-2·h-1(图3a)和-15.91～28.92 μg·m-2·h-1(图3b)。与2019年相比，2018年生长季表现出较高的N2O通量(图3a，3b)，在2018年生长季，N添加和P添加显著降低了N2O通量(7.21 μg·m-2·h-1，4.11 μg·m-2·h-1，P<0.05)，NP添加对N2O通量无显著影响(图3c)。2019年生长季P添加显著降低了N2O通量(4.62 μg·m-2·h-1，P<0.05)，氮添加和氮、磷同时添加分别对两年N2O通量没有显著影响(图3d)。三因素重复测量方差分析发现，NP添加促进了N2O释放(P<0.001，表1)；单独N添加显著影响N2O通量的年际动态(P<0.05，表1)；N、P添加与年际效应三者交互作用显著影响N2O通量(P<0.05，表1)，且N2O通量存在显著的年际差异(P<0.001，表1)。

图3 2018-2019 年生长季N2O通量的季节动态和均值Fig.3 The seasonal variation and mean values of N2O flux in 2018 and 2019 growing seasons

2.4 N2O通量与生物、非生物因子的关系

图4 N2O通量与相关因子的相关性Fig.4 Correlations between N2O flux and related factors

结构方程模型显示，土壤硝态氮、铵态氮和含水量是调控N2O排放的关键因素。N添加可直接或间接影响铵态氮和硝态氮进而影调控N2O排放；P添加影响地上生物量，而地上生物量和土壤含水量通过影响土壤温度来影响铵态氮调节N2O排放；土壤含水量也可以直接调控N2O排放；模型解释度为57%。土壤无机氮和土壤含水量直接影响了氧化亚氮通量，土壤温度和地上生物量间接影响了氧化亚氮排放，其中土壤无机氮的调控作用最强。

图5 基于结构方程模型的氮、磷添对氧化亚氮排放直接和间接的影响Fig.5 Structural equation model (SEM) direct and indirect effects of the effects of N addition and P addition on N2O flux通过地上生物量，途径研究氮、磷添加对土壤N2O通量影响的结构方程模型(SEM)，模型拟合结果良好。红色箭头表示负效应，黑色箭头表示正效应。绿色表示生物因素，灰色表示非生物因素。拟合结果：R2=0.57,P=0.096,RMSEA=0.085Structural equation model (SEM) of the effects of N addition and P addition on N2O flux through pathways of biomass. The fitting result of the model is good. Red arrows indicate negative effects,and black arrows indicate positive effects. Green indicates abiotic factors,and gray indicates biological factors. Results of model fitting:(R2=0.57,P=0.096,RMSEA=0.085)

3 讨论

单独氮添加提高了2018年生长季硝态氮水平，抑制了N2O的排放；单独磷添加抑制了2018和2019年生长季N2O排放，这是因为磷添加增加了地上生物量，减少了铵态氮与土壤含水量共同调控N2O的结果；氮、磷同时添加后，受到多种因素的共同作用，对两年的N2O通量无显著影响。Tian等[4]的研究实现对全球N2O源和汇的全面量化，发现两个关键的生化过程硝化和反硝化控制着N2O的排放。Thompson等[23]通过大气反演得到高氮水平促进了N2O的排放，进一步得到N2O排放在全球和区域水平上是具有非线性响应的，并提出在2000—2005年和2010—2015年之间全球的N2O排放量增加了1.6 TgN·yr-1，提高氮的利用效率是减少N2O排放的有效手段。对于氮、磷添加影响N2O的机制，不同的研究者有着不同的观点。通常认为，氮添加通常会促进氮矿化，增加硝化和反硝化反应的底物，从而促进N2O的排放[24-25]，这与本研究2019年试验结果一致；有研究表明，氮添加可降低参与产生N2O的硝化和反硝化过程的微生物丰度，从而减少N2O的排放[26]；磷添加促进了植物对无机氮的吸收同样减少了N2O的排放[27-28]；Xia等[29]进行了为期10周的精准控制培养实验，研究发现硝化过程促进草地土壤中排放的N2O和固碳的净温室气体平衡(以CO2当量衡量)，发现在没有大量氮输入的情况下，硝化过程中释放的N2O可以被以AOA为主的自养生物所固定的碳所抵消；Ping等[30]在中国温带沙漠的研究表明N2O排放与功能基因丰富度有关，氮添加增加了氨氧化细菌(AOB)、氨氧化古菌(AOA)和硝酸还原酶的丰富度，对N2O产生积极作用，在澳大利亚草地的研究发现土壤反硝化微生物的活动受到土壤有效磷的刺激，而参与硝化过程的微生物几乎不会受到有效磷刺激[31-32]，本实验没有涉及相关酶细菌丰度及对应的酶，如需验证还需补充相关指标。

本研究发现两年N2O排放量存在显著的年际差异，这与2018年生长季较高的降水频率和降水量有关。与2019年相比，2018年较低的土壤含水量有利于N2O排放，同时增加土壤温度和铵态氮含量，减轻了N2O排放的限制。由于降雨造成的干湿交替也可能是造成2018年生长季的N2O排放，内蒙古羊草草原的研究发现，土壤水分变化频繁和显著时，土壤的干湿交替使硝化作用与反硝化作用交替产生N2O，同时这种干湿交替可以抑制土壤N2O向N2的还原[37]。

由于只有两年的研究结果，长期氮、磷添加对农牧交错带草地生态系统过程的影响还需要继续进行深入系统的研究，才能更加准确预测全球变化背景下温室气体对全球温度升高的贡献，为农牧交错带草地管理提供科学依据。

4 结论

单独氮添加提高了2018年生长季硝态氮水平，抑制了N2O的排放；单独磷添加下，土壤铵态氮与土壤含水量的共同作用抑制了2018和2019年生长季N2O排放；氮、磷同时添加削弱了单独氮或磷添加对N2O排放的抑制作用，是由于增加了硝态氮向铵态氮的转化，促进铵态氮向N2O的转化过程。农牧交错带N2O通量受硝态氮、铵态氮和土壤含水量的主调控，并存在年际间差异，因此，农牧交错带草地养分管理对N2O通量的影响应综合考虑降水格局的变化。