蒙古冰草ERF转录因子生物信息学及其表达分析

吴 婧，范菠菠，张学峰，宋金微, 房永雨，于 卓，闫秀秀，赵 彦，马艳红*

(1.内蒙古农业大学农学院，内蒙古 呼和浩特 010019；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；3.内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

转录因子(Transcription Factors，TFs)在植物中是一种最重要的一类调节基因，可与真核生物基因的启动子区域中顺式作用元件发生特异性结合的DNA结合蛋白，通过与其他蛋白相互作用，激活或抑制基因转录[1]。根据DNA结构域的特点，将转录因子分为若干个家族，如WRKY，AP2/EREBP，NAC，MYB，BZIP，其中AP2/EREBP是植物中分布广泛的一类转录因子[2]。根据AP2/EREBP转录因子保守结构域的不同，AP2/ERFBP家族被进一步分为AP2，RAV，DREB，ERF和Soloist五个亚族[3]。ERF是AP2/ERFBP家族中最大的一类亚族[4]。ERF转录因子参与植物多种生物学过程，与非生物胁迫密切相关，如干旱[5-6]、低温[7]、高盐[8]、病害[9]。ERF转录因子通过参与乙烯、脱落酸、茉莉酸和水杨酸等信号转导途径，调控下游基因的表达，从而综合提高植物的抗逆性[10]。到目前为止，在PlantTFDB数据库中，共收录了166种作物的ERF转录因子，共有21 129个。

干旱是限制植物生长的重要因素，会诱导植物发生渗透失衡等不良反应，妨碍植物各阶段的生长发育和代谢，进而影响农作物的产量[11]。大量研究表明，ERF转录因子参与干旱胁迫，如拟南芥(Arabidopsisthaliana)DREB2A基因的表达受脱水诱导引起植株矮化[12]。大豆(Glycinemax)在模拟干旱条件下，转基因烟草GmERF3[13]过表达，导致游离脯氨酸含量多于野生型烟草，可提高烟草的抗旱性，大豆GmERFb对干旱产生响应[14]。小麦野生近缘植物纤毛鹅观草(Roegneriaciliaris(Trin.)Nevski)中的RcDREB1基因对干旱、高盐和重金属非生物胁迫产生应答[15]。小麦(Triticumaestivum)TaERF1在干旱胁迫和外源ABA、乙烯和水杨酸的诱导条件下，TaERF1过表达可激活与逆境相关的基因[16]。粳稻(Oryzasativa)中第Ⅶ亚族的ERF转录因子OsLG3通过诱导活性氧可提高旱稻的抗旱能力[17]，OsERF3基因其含有EAR抑制结构域基序，对干旱胁迫起负调控作用[18]。

蒙古冰草(AgropyronmongolicumKeng)原名沙芦草，抗逆性强，是优质的多年生二倍体禾本科牧草[19]。迄今，体内的多种抗逆基因尚未被发现，作为小麦族牧草，研究蒙古冰草的抗逆基因对牧草及麦类的遗传改良具有重要意义。ERF参与植物生长和逆境胁迫响应，但蒙古冰草ERF转录因子的研究尚属空白。本研究基于干旱胁迫下蒙古冰草的RNA-Seq，旨在筛选可能与抗旱相关的ERF转录因子，为下一步开展蒙古冰草抗旱基因功能解析奠定理论基础。

1 材料与方法1.1 试验材料与处理

本试验材料为蒙古冰草(A.mongolicumKeng)，种子采自于内蒙古农业大学萨拉齐牧草繁种基地。挑选颗粒饱满的种子于室内培养箱(BIC-300)水培生长，温度为(24±1)℃、光周期为16 h，在三叶一心时期用含25%的PEG-6000的1/5 Hoaglands营养液进行模拟干旱处理，同时设置对照处理(CK)，之后在干旱12 h，24 h，48 h，3 d，5 d，7 d及复水24 h取样，每个处理时期3次重复，提取total RNA，委托杭州联川生物技术股份有限公司进行转录组测序[20]。

1.2 蒙古冰草ERF转录因子筛选

从干旱胁迫下蒙古冰草转录组测序数据中(NCBI Bioproject accession number PRJNA742257，SRA accession number SUB9924544 and SUB9990857)，根据功能注释初步筛选出41个ERF转录因子，利用notepad++软件找到核苷酸序列，用NCBI中的ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)阅读框将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，使用PlantTFDB中的Prediction(http://planttfdb.gao-lab.org/prediction.php)进行分析，筛选出具有ERF结构域的氨基酸序列，然后用该网站中的BLAST(http://planttfdb.gao-lab.org/blast.php)与所有的物种进行同源比对，除去与其他物种无同源性的ERF蛋白序列。

1.3 蒙古冰草ERF转录因子理化性质分析及亚细胞结构定位

利用在线分析软件Expasy中的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)[21]对筛选出的蒙古冰草ERF转录因子的氨基酸数目、相对分子质量、PI值、脂肪指数、亲疏水性的理化性质进行分析；用Cell-PLOC 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)[22]对蒙古冰草ERF转录因子进行亚细胞结构定位预测。

1.4 蒙古冰草ERF转录因子保守基序及序列比对

用在线分析软件The MEME Suite中的MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)[23]对筛选出来的蒙古冰草ERF转录因子的保守基序进行分析；使用DNAMAN软件进行多序列比对，然后用WebLogo 3(http://weblogo.threeplusone.com/)[24]对蒙古冰草ERF保守结构域进行预测。

1.5 蒙古冰草ERF进化关系分析

通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和UniProt(https://www.uniprot.org/)数据库、PlantTFDB(http://planttfdb.gao-lab.org/index.php)的ERF数据库，筛选出具有抗旱功能的13条拟南芥(Arabidopsisthaliana)、6条山羊草(Aegilopstauschii)、9条二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、4条大麦(Humuluslupulus)、5条籼稻(Oryzasativasubsp.indica)、8条粳稻(Oryzasativasubsp.japonica)、4条小麦(Triticumaestivum)的ERF氨基酸序列，并与蒙古冰草的ERF转录因子的氨基酸序列用MEGA7.0[25]的Muscle进行多序列比对，用相邻连接法(neighbor-joining)构建系统进化树。设置校验参数Boostrap为1000，其他参数均设为默认值。用EvolView(https://evolgenius.info//evolview-v2/#mytrees/1/2)[26]将进化树进行美化。

表1 已报道抗旱相关ERF转录因子

1.6 蒙古冰草ERF转录因子二、三级结构预测

利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa_ sopma.html)对蒙古冰草ERF转录因子二级结构预测分析，并用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在线软件的同源建模法对其三级结构进行预测分析。

1.7 不同干旱处理蒙古冰草ERF转录因子基因差异表达分析

蒙古冰草转录组数据库使用TPM(Transcripts per million)对样本表达量进行归一化处理，利用DESeq2软件分析不同处理间的差异基因。用软件Heml对蒙古冰草ERF转录因子的共表达模块与性状矩阵进行关联分析，并用Color Dialog对其进行颜色处理，分析其在不同干旱处理下的差异表达情况。

1.8 蒙古冰草ERF转录因子qRT-PCR

使用primer premier 5将筛选出的可能具有抗旱功能的蒙古冰草ERF转录因子(AmERF053,AmERF1B,AmERF4-1,AmERF4-2)进行引物设计，以U6作为内参基因，(引物序列见表2)，然后将引物委托上海生工(Sangon，上海)进行序列合成。

表2 蒙古冰草抗旱相关ERF基因qRT-PCR引物序列

使用Trizol法提取蒙古冰草CK，干旱处理1 d,3 d,5 d,7 d及复水24 h的总RNA，使用FastKing RT Kit(with gDNase)试剂盒将蒙古冰草处理组及对照组的Total RNA反转录为cDNA，用MonAmp SYBR Green qPCR Mix试剂盒(MQ10201S)进行qRT-PCR试验，每个处理4次生物学重复。qRT-PCR总反应体系为20.0 μL，其中上下游引物(10 μM)各0.4 μL,cDNA模板1.2 μL,Nuclease-Free Water 8 μL,MonAmp SYBR Green qPCR Mix试剂10 μL。反应程序为预变性95℃,30 s，变性95℃,10 s，退火61℃,10 s，延伸72℃,30 s，循环数为40，在FTC-3000P上运行程序。按照2-ΔΔCT法[35]计算基因的相对表达量，并使用SPSS 26.0软件对其差异显著性分析。

2 结果与分析2.1 蒙古冰草ERF基因筛选

从蒙古冰草转录组数据库中的41 793条Unigenes中筛选出41个ERF基因，通过ORF和结构域预测分析，获得具有ERF结构域的25个基因。BLAST序列比对发现，有18个与其他物种具有亲缘关系，其中DN17657_c2_g1,DN22794_c0_g6,DN22189_c0_g1与山羊草(Aegilopstauschii)亲缘关系最近，相似度在66%～84%之间；DN20439_c0_g14,DN22390_c0_g1,DN25557_c0_g6,DN23100_c2_g10,DN22189_c1_g2,DN19595_c1_g1与小麦(Triticumaestivum)亲缘关系最近，相似度在61%～78%；DN26859_c0_g2,DN25557_c0_g4,DN25557_c0_g1,DN26859_c0_g7,DN22794_c0_g2与大麦(Hordeumvulgare)亲缘关系最近，相似度在55%～70%之间；DN19955_c0_g1与二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)亲缘关系最近，相似度为50%；DN26921_c0_g2与拟南芥(Arabidopsisthaliana)亲缘关系最近，相似度为79%，表明从蒙古冰草的ERF转录因子基因结构具有保守性，与山羊草(A.tauschii)、小麦(T.aestivum)、大麦(H.vulgare)同源性较高。

2.2 蒙古冰草ERF转录因子理化性质及亚细胞定位分析

18个蒙古冰草的ERF转录因子氨基酸数目在70 aa～404 aa之间，相对分子质量介于7 447.54～43 654.9之间；理论等电点(PI)在4.53～11.10之间，有11个ERF转录因子理论等电点小于7、呈现酸性，有7个ERF转录因子大于7、呈现碱性；脂肪族指数最小为47.61，最大为75.71；有16个ERF转录因子总平均亲水性小于0，为亲水性蛋白，仅有两个总平均亲水性大于零，为疏水性蛋白(表3)。

蒙古冰草ERF转录因子基因亚细胞定位分析，有13个ERF转录因子定位在细胞核中，AmERF071,AmERF014定位在细胞质中，AmERF008存在于细胞核和细胞质中，AmERF3-2定位在细胞膜上，AmERF110-2定位在细胞外，表明ERF转录因子基因主要在细胞核中发挥功能(表3)，少数在细胞质、细胞膜、细胞外发挥功能。

表3 蒙古冰草ERF转录因子理化性质及亚细胞定位

2.3 蒙古冰草ERF转录因子基序分析

蒙古冰草ERF转录因子保守基序分析发现7种motif(图1)，有16个ERF转录因子氨基酸序列出现保守的motif，AmERF061-1和AmERF110-2转录因子不含有motif。在含有motif的序列中，有15个ERF转录因子含有motif2、14个ERF转录因子含有motif1、13个ERF转录因子含有motif3、6个ERF转录因子含有motif6、2个ERF转录因子含有motif7、2个ERF转录因子含有motif5，同时含有基序motif1，motif2，motif3的序列有12个，出现的次数最多。motif1特征基序的(x)GRR(x)EI、motif2基序(x)RWLG(x)AA(x)D和motif3基序(x)G(x)N(x)构成AP2的结构域特征序列，且motif1,motif2,motif3通常以串联形式在一起，所以推测motif1,motif2,motif3基序为蒙古冰草ERF转录因子的保守基序(图2)。

图1 蒙古冰草ERF转录因子基序分析

图2 蒙古冰草ERF转录因子的保守基序

通过DNAMAN软件对18个蒙古冰草ERF基因编码的氨基酸序列进行多序列比对，发现AmERF061-1,AmERF061-2,AmERF1,AmERF014,AmERF110-2不具有AP2结构域，AmERF061-1和AmERF061-2氨基酸序列发生变化，AmERF1的C端发生缺失，AmERF014的N端发生缺失，AmERF110-2的N端发生变化、而C端发生缺失(图3)。用WebLogo3分析18个蒙古冰草ERF转录因子的保守性，其存在AP2结构域特征序列(x)GRR(x)EI(x)RWLG(x)AA(x)D(x)G(x)N(x)，在第二个β-折叠中第14位氨基酸是丙氨酸(A)，19位是天冬氨酸(D)(图3,图4)。

图3 蒙古冰草ERF家族基因的氨基酸序列比对

图4 蒙古冰草ERF转录因子家族的保守结构域

2.4 蒙古冰草ERF转录因子进化关系分析

本研究将蒙古冰草ERF与玉米(Zeamays)ZmDREB160，大豆GmERF4,GmERF6，马铃薯(Solanumtuberosum)StERF1，小麦TaERF1等具有抗旱功能的转录因子构建进化树，结果将ERF转录因子划分为10个亚族，其中有5个亚族不含有蒙古冰草ERF转录因子。第Ⅰ亚族和第Ⅴ亚族分别有1个ERF转录因子，AmERF008划分在第Ⅰ亚族，AmERF014划分在第Ⅴ亚族；第Ⅱ亚族中有3个ERF转录因子，分别是AmERF071,AmERF061-1,AmERF061-2,AmERF053和AmERF060两个转录因子划分在第Ⅵ亚族，其中AmERF053与拟南芥AT2G20880.1(AtERF53)聚为一个分支；第Ⅲ亚族是最大的亚族，共有10个蒙古冰草ERF转录因子在此亚族中，其中AmERF3-1，AmERF4-3,AmERF1聚在一个分支，AmERF3-2,AmERF114,AmERF110,AmERF109聚在一个分支上，AmERF4-1与大豆GmERF6、马铃薯StERF1、拟南芥AtERF9在一个小分支，AmERF4-2与大豆GmERF4聚在一个小分支，AmERF1B与拟南芥AtERF11在一个分支。根据MEGA分族及各族的成员推测蒙古冰草ERF转录因子的功能，StERF1,AtERF9,GmERF6,GmERF4,AtERF11,AtERF53这些转录因子均被证明与干旱胁迫相关，根据以上结果推测蒙古冰草AmERF4-1,AmERF4-2,AmERF1B,AmERF053也具有相似的功能，可能参与干旱胁迫响应。

2.5 蒙古冰草ERF基因不同干旱处理表达模式分析

蒙古冰草在干旱处理 12 h,24 h,48 h,3 d,5 d,7 d、复水 24 h及对照(CK)情况下，其中15个ERF基因表达量呈显著差异表达(图6)。基因表达量的大小与数值有关，数值越大表达量越大，表达量越大越接近红色，表达量越小越接近蓝色。6个ERF基因表达量较高，其中AmERF3-1基因表达量最高。AmERF110和AmERF061-1两个基因有表达，但是表达量较低在0～2之间，视为无效表达。随着干旱处理时间延长，AmERF053,AmERF4-1,AmERF3-1,AmERF3-2,AmERF109和AmERF114共6个基因表达量呈现上调趋势，AmERF1B,AmERF071,AmERF110-2,AmERF060共4个基因的表达量随着干旱处理的进程呈现先升高后降低的趋势，复水24h上调，随着干旱处理的进程AmERF1基因表达量与CK相比较呈现先降低后升高的趋势，AmERF4-2和AmERF061-2基因表达量随着干旱处理过程中先升高后降低再升高。虽然都属于ERF家族，但ERF转录因子在不同干旱处理下表达模式存在差异。

图6 蒙古冰草ERF基因不同干旱表达模式

2.6 蒙古冰草抗旱相关的ERF转录因子二、三级结构

对蒙古冰草AmERF053,AmERF1B,AmERF4-1和AmERF4-2转录因子进行二级结构预测，主要以无规则卷曲为主，分别占59.03%,51.85%,61.32%和51.05%，其次是α-螺旋，分别占26.65%,34.68%,22.22%和32.49%，延伸链分别占9.69%,9.43%,12.35%和10.97%，β-折叠分别占4.63%，4.04%,4.12%和5.49%，表明4个蒙古冰草抗旱相关的ERF转录因子的二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主。

根据SWISS-MODEL的同源建模法对AmERF053,AmERF1B,AmERF4-1和AmERF4-2四个ERF转录因子的三级结构建模结果显示(图8)，4个ERF三级结构都与拟南芥的ERF转录因子相匹配，含有AP2结构域，符合ERF结构域特征，三级结构与二级结构相吻合，且有1个α-螺旋，3个β-折叠的空间结构。

图7 蒙古冰草ERF转录因子二级结构预测

图8 蒙古冰草ERF转录因子三级结构

2.7 蒙古冰草ERF基因的表达分析

对筛选出的与抗旱相关的蒙古冰草4个ERF基因进行RT-qPCR分析，4个ERF基因对干旱胁迫响应程度不同，AmERF053,AmERF1B和AmERF4-1呈现上调表达；AmERF053和AmERF1B两个基因在5 d表达量最高，AmERF4-1在3 d表达量最高；AmERF4-2各个处理组的表达量均低于CK，呈现下调表达。在0.05水平上，4个ERF基因的处理组表达量均与CK的表达量存在显著性差异，说明蒙古冰草ERF家族基因参与蒙古冰草对干旱胁迫的响应。

图9 干旱胁迫下蒙古冰草抗旱相关的ERF基因相对表达量

3 讨论

为筛选蒙古冰草抗旱相关的ERF转录因子，本研究基于生物信息分析，筛选出25个具有ERF结构域的基因，通过BLAST序列比对发现，18个序列与其他物种具有亲缘关系，7个序列与其他物种无亲缘关系，总共筛选出16个具有AP2保守结构域的ERF转录因子。ERFs一般含有1个AP2保守结构域，AP2结构域由60～70个氨基酸残基组成[36]，蒙古冰草ERF的AP2结构域N端含有3个β-折叠片段，C端有1个α-螺旋片段，在N端含有YRG保守元件，呈碱性，C端含RAYD保守元件，这可能与其他蛋白互作有关[37]，蒙古冰草ERF的AP2序列与大豆[38]、油橄榄(Oleaeuropaea)[39]ERF家族氨基酸序列一致。在同一基因家族中，拥有共同的保守基序可能发挥相似的功能[40]。在蒙古冰草ERF转录因子保守基序分析中，共出现了7个motif，其中motif1,motif2和motif3出现次数最多，通常以串联形式出现，是其共同含有的保守基序，motif1含有YRG保守原件，motif2含有RAYD保守原件，与桃、苹果、拟南芥ERF转录因子家族具有相似的结构[41-43]。

通过对蒙古冰草ERF转录因子的理化性质分析发现大多数为亲水性蛋白，与马铃薯StERF109的ERF蛋白亲疏水性保持相似[44]。亚细胞定位表明蒙古冰草ERF转录因子大多数在细胞核中发挥功能，少数在细胞质和其他部位发挥功能，和木薯(Manihotesculenta)[45]、小麦[46]亚细胞定位情况相似。根据4个ERF蒙古冰草转录因子的二、三级结构的结果显示，ERF主要以无规则卷曲为主，α-螺旋次之，与小黑杨(Populussimonii×P.nigra)ERF723[47]的二、三级结构相似，其三级结构有些差异，可能其所处亚族不同，这些差异与α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲的长度有关，这些差异会使其发挥不同的功能[48]。

ERF转录因子在植物生长发育和抵御外界胁迫发挥着不同的作用[49]。蒙古冰草ERF转录因子和具有抗旱功能的ERF转录因子进行系统进化关系分析，拟南芥AtERF9[33],AtERF11[34],AtERF53[32]与GCC box或下游基因启动子的脱水反应元件结合，调控干旱应答基因的表达从而提高植株的抗旱能力。将大豆GmERF6[29]基因转入到拟南芥中，经过断水处理与野生型植株相比较，转基因植株的种子发芽率高且正常生长、开花，在干旱胁迫下，GmERF4[28]在干旱处理后24 h内基因表达量显著增加。StERF1在干旱处理后SDR(短链脱氢酶)、游离脯氨酸、丙二醛(MDA)等含量明显增加，转基因植株的株高、茎高、根长、鲜重等指标都高于未转基因的植株，过量表达的StERF1可提高马铃薯的抗旱能力[30]。这些均被证明与干旱胁迫响应有关，且与蒙古冰草有较高的同源性，进而推测蒙古冰草AmERF4-1,AmERF4-2,AmERF1B,AmERF053也具有相似的功能，可能参与干旱胁迫响应。

经过qRT-PCR验证4个蒙古冰草ERF基因处理组的表达量与CK组相比较存在显著性差异，既有正向调控又有负向调控，AmERF053,AmERF1B和AmERF4-1呈现上调表达，与赵梦雨研究结果一致，其通过qRT-PCR分析结果表明，苦荞(Fagopyrumtataricum)FtDREB6转录因子在干旱胁迫下起正调控作用[50]，赵彦对蒙古冰草MwDREB3基因进行实时荧光定量RT-PCR，结果分析表明MwDREB3在干旱胁迫下表达量上调[51]。AmERF4-2呈现下调表达，目前，关于ERF基因下调表达的研究较少较少，从水稻中发现OsERF109基因通过抑制乙烯的释放从而对水稻的抗旱性起负调控作用[52]。

4 结论

本研究基于蒙古冰草转录组测序数据筛选出41个ERF转录因子，其中18个具有ERF结构域特征，通过对其保守基序、保守结构域、进化关系及表达模式分析，获得4个可能具有抗旱功能的蒙古冰草ERF转录因子，其二、三结构主要以无规则卷曲为主。对4个ERF基因进行差异表达分析，qRT-PCR结果分析表明AmERF053,AmERF1B和AmERF4-1起正调控作用，AmERF4-2呈现负调控作用。